宋欠紅 樊 睿 朱虹江 李云華 蘇玉杰 鄧遠芬 趙 淳

（云南中醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，云南 昆明 650021）

膿毒癥（sepsis）是臨床難治病、多發(fā)?。?］。 在重癥患者中發(fā)病率高，耗費大量醫(yī)療資源。盡管醫(yī)療技術日漸進步，但病死率仍高達30%~70%［2］。大部分膿毒癥患者臨床表現(xiàn)有發(fā)熱，屬中醫(yī)學“外感熱病”“溫毒”等范疇［3］。膿毒癥常引起腸道功能紊亂，腸壁充血水腫、壞死、腸黏膜破壞，導致大量內(nèi)毒素釋放入血，引起膿毒血癥［4］。中醫(yī)藥治療膿毒癥可通過多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點發(fā)揮治療作用［5］。清毒提取液是全國名中醫(yī)趙淳教授治療膿毒癥熱毒蘊結、陽明腑實證的常用方劑，臨床療效顯著。其組方原則主要是根據(jù)膿毒癥主要病機為菌、毒、炎浸淫三焦，三焦熱盛，熱毒內(nèi)侵，陽明腑實所確定的［6］。本實驗通過觀察清毒提取液對膿毒癥大鼠小腸組織病理學改變，及對血清腸型脂肪酸結合蛋白（IFABP）、D-乳酸水平的調節(jié)，探討其對膿毒癥大鼠腸黏膜屏障功能保護作用［7-9］，觀察血清谷丙轉氨酶（ALT），尿素氮（BUN），肌酐（Cr）水平，研究其對肝腎功能的保護作用。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性Wistar大鼠90只，體質量 260～300 g，許可證號：SCXK（滇）2015-0003，大鼠合格證號：430067000007126，由昆明醫(yī)科大學動物中心提供。大鼠自由飲水進食，實驗前1周在實驗環(huán)境中飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度（22±2）℃，濕度40%~70%。

1.2 試藥與儀器 清毒提取液制備，具體組方為生大黃 15 g，炒黃連 15 g，炒黃芩 10 g，黃柏 10 g，梔子15 g［10-11］。 以上 5味，共 10劑劑量。 藥物浸泡 30 min，水煎2次，首煎生大黃后下10 min。加6倍量水，每次煎20 min，2次藥液混勻。減壓濃縮經(jīng)0.2 μm過濾器過濾并調整質量濃度至1 g/mL（按生藥計算）［12］。由云南中醫(yī)學院臨床醫(yī)學院制劑室提供。注射用烏司他汀購自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司。D-乳酸試劑盒購自上海新睿生物科技有限公司，IFABP試劑盒購自上海晶抗工程有限公司，BUN試劑盒購自北京綠源伯德生物科技有限公司，以上3種采用ELISA檢測。ALT試劑盒購自上海朝瑞生物科技有限公司，賴氏比色法檢測。Cr試劑盒購自上海吉如生物科技有限公司，肌氨酸氧化酶比色法檢測。主要儀器：FA/JA型電子天平（上海方瑞儀器有限公司生產(chǎn)）；723 SPC型分光光度計（上海奧析科學儀器有限公司生產(chǎn)）；PSD800型離心機（蘇州星億機械有限公司生產(chǎn)）。

1.3 造模與分組 將大鼠用數(shù)字表法隨機分為6組，分別為假手術組（n＝10）、模型組（n＝10）、烏司他汀組（n＝10）、清毒提取液低劑量組（n＝20）、清毒提取液中劑量組（n=20）和清毒提取液高劑量組（n＝20）。動物模型制作參照陸焱等［16］報道的方法基礎上進行改良，復制腹腔感染型膿毒癥大鼠模型。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠。在下腹部正中切長約2 cm切口，分離盲腸與大腸的系膜，將腸腔內(nèi)糞便擠向遠端，用滅菌3號絲線結扎盲腸，保持腸道通暢。在結扎范圍內(nèi)用12號針頭穿刺兩次腸壁，形成腸瘺，兩個針孔相距約3 mm，為防止傷口愈合在第2針孔內(nèi)放置一條寬2 mm的橡膠引流片。關閉腹腔，逐層縫合。為補充手術過程中體液的丟失術后立即皮下注射生理鹽水，劑量1 mL/100 g體質量。假手術組只打開腹腔，不做盲腸造瘺，然后逐層縫合腹壁。

1.4 給藥方法 清毒提取液成人每日用量為65 g，實驗大鼠與成人用藥量按照成人與大鼠體質量比例計算，方法：成人用量（以體質量 70 kg計）×0.0026×50=大鼠用量/體質量（kg）［13-14］。清毒提取液低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予 4.25、8.5、17 mL/kg。于盲腸結扎穿孔術前1 h和術后24、48、72、84 h分別給大鼠清毒提取液灌胃、0.9%氯化鈉注射液灌胃、烏司他汀靜脈注射。假手術組和模型組予以0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg灌胃。烏司他汀組予以注射用烏司他汀13000 U/kg尾靜脈注射［15］。注射用烏司他汀10萬單位加入0.9%氯化鈉注射液10 mL，使用41/2針頭，左側尾靜脈注射。

1.5 標本采集與檢測 于盲腸結扎穿孔術后96 h使用10%水合氯醛（2.4 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，待麻醉生效后，將大鼠仰臥位固定。于股動脈處取血約3 mL，待血液在試管中自然凝固后，予以離心，取上清液即血清分裝于ependor管置于-20℃冰箱，進行檢測。取回盲部上段3 cm處回腸組織為取材處，剪取回腸腸管長約1.5 cm，用0.9%氯化鈉注射液將腸管沖洗干凈，用4%多聚甲醛浸泡固定，用于制作石蠟切片。依次使用75%，80%，95%，100%梯度酒精脫水，二甲苯脫蠟、蘇木素-伊紅素染色制作切片標本，光學顯微鏡下觀察病理變化［17］。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，計量資料采用 t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組小腸組織病理學改變 見圖1。光鏡下可見，假手術組腸上皮細胞無破壞，無缺損，小腸黏膜完好，絨毛排布規(guī)整。模型組小腸上皮細胞有脫落，壞死，連續(xù)性中斷，絨毛排列紊亂，炎癥細胞浸潤，毛細血管出血。烏司他汀組小腸黏膜不完整，腸上皮細胞有壞死，小腸絨毛增粗，有缺損和斷裂。清毒提取液高劑量組，腸上皮細胞破壞較模型組輕，小腸絨毛排列欠整齊，有缺損，毛細血管出血。

圖1 各組小腸組織病理學改變（HE染色，200倍）

2.2 各組大鼠血清IFABP、D-乳酸水平比較 見表1。清毒提取液低、中、高劑量組與模型組比較，均可以明顯降低IFABP水平（P＜0.05）；清毒提取液中、高劑量組與模型組比較，可以明顯降低D-乳酸水平 （P＜0.05）；清毒提取液低、中、高劑量組與烏司他汀組比較，IFABP、D-乳酸水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組血清IFABP、D-乳酸水平比較（±s）

表1 各組血清IFABP、D-乳酸水平比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05。下同。

組 別 n I F A B P （n g/m L） D-乳酸（m m o l/L）假手術組 1 0 1 3.0 3±2.2 6 0.5 5±0.0 5模型組 7 2 9.2 8±5.0 5 1.4 7±0.2 2烏司他汀組 1 0 1 8.5 9±3.2 4 0.8 2±0.1 3清毒提取液低劑量組 1 1 1 7.1 1±4.2 2* 1.1 1±0.2 8清毒提取液中劑量組 9 1 7.6 7±3.7 7* 0.7 6±0.1 2*清毒提取液高劑量組 9 1 6.8 9±4.0 1* 0.7 4±0.1 1*

2.3 各組大鼠血清ALT、BUN、Cr水平比較 見表2。清毒提取液低、中、高劑量組與模型組比較，均可以明顯降低ALT水平（P＜0.05）；清毒提取液低、中、高劑量組與模型組比較，可以明顯降低BUN水平（P＜0.05）；清毒提取液低、中、高劑量組與模型組比較，可以明顯降低Cr水平（P＜0.05）；清毒提取液低、中、高劑量組與烏司他汀組比較，ALT、BUN、Cr水平差異均無統(tǒng)計學意義。

表2 各組 ALT、BUN、Cr水平比較（±s）

表2 各組 ALT、BUN、Cr水平比較（±s）

組 別 n A L T（U/L）假手術組 1 0 2 3.7 4±5.5 6模型組 7 1 6 5.3 1±1 6.4 3烏司他汀組 1 0 1 2 3.6 2±1 0.2 4清毒提取液低劑量組 1 1 1 3 0.5 2±1 2.2 8*清毒提取液中劑量組 9 1 3 6.8 7±1 0.7 7*清毒提取液高劑量組 9 1 2 5.3 2±1 1.0 1*B U N（m m o l/L） C r（μ m o l/L）5.7 0±1.0 2 5 3.6 4±6.3 2 1 9.1 1±3.2 3 2 2 1.3 1±1 9.7 6 1 1.0 2±2.2 4 1 4 8.2 5±1 3.4 7 1 0.2 5±2.0 9*1 3 3.8 3±1 2.6 1*1 1.5 4±2.7 4*1 4 0.5 0±1 3.9 9*9.1 8±2.5 5*1 3 6.6 9±1 3.2 5*

3 討 論

膿毒癥所致的腸黏膜破壞，腸壁充血水腫、壞死，是引起腸功能障礙的主要原因。應用盲腸結扎穿孔法復制的膿毒癥模型，其膿毒癥機制符合熱毒蘊結陽明大腸，陽明熱盛、腑實的特點。因腸道有多種細菌，形成腸瘺后，細菌快速繁殖，并產(chǎn)生大量內(nèi)毒素，故膿毒癥發(fā)生急劇、嚴重。膿毒癥大鼠肝、腎功能受到嚴重損傷，是造成死亡的主要原因。至實驗結束時，大鼠死亡分別達到假手術組0/10，模型組13/20，烏司他汀組10/20，清毒提取液低、中、高劑量組分別達到9/20，11/20，11/20，其發(fā)病急，死亡率高，與臨床觀察的發(fā)病狀況相似。

清毒提取液為黃連解毒湯加大黃而成，以大黃、黃連、黃芩、黃柏、梔子按比例（3∶3∶2∶2∶3）組方［18-19］。 不僅瀉火解毒力強，而且有引熱下行之功，使熱邪從大腸而泄，能蕩滌陽明熱邪，對濕熱瘀毒壅滯胃腸有明顯療效，對減輕腸黏膜損傷有顯著作用。D-乳酸是由腸道內(nèi)多種細菌如乳酸菌、克雷伯桿菌、大腸桿菌等產(chǎn)生的，正常情況下并不產(chǎn)生該物質。當腸道黏膜受損時，血清D-乳酸水平明顯升高，故血清中D-乳酸水平升高程度與腸黏膜損害程度呈正相關。腸型脂肪酸結合蛋白能夠反映腸上皮細胞的通透性，當膿毒癥時，腸黏膜損傷，細菌移位，腸上皮細胞通透性增加，腸型脂肪酸結合蛋白釋放入血，IFABP水平升高。本實驗中清毒提取液中、高劑量組與模型組比較，均可以明顯降低IFABP、D-乳酸水水平，提示清毒提取液能夠改善腸黏膜的損傷，降低腸上皮細胞的通透性，以減少細菌、毒素從腸道吸收入血液。模型組ALT、BUN、Cr與假手術組比較均有數(shù)倍的增高。模型組ALT、BUN、Cr分別為假手術組的7、3、4倍，表明膿毒癥時肝腎功能嚴重受損。而清毒提取液能有效降低ALT、BUN、Cr水平，減輕膿毒癥對肝腎功能的損害。

清毒提取液組方具有清熱解毒、瀉火攻下，蕩滌濕熱毒邪之功，屬釜底抽薪之法。三黃清解三焦火毒，梔子引邪從小便而出，大黃瀉火攻下，清解陽明熱毒，蕩滌濕熱毒邪。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)［20］，黃芩具有解熱、抑菌、抗炎、保肝、抗氧化作用。黃連具有廣泛抗菌作用，有解熱、抗炎、保肝、利膽作用。黃柏具有抗炎、抑菌、抗變態(tài)反應作用。梔子具有解熱、抗炎、抗內(nèi)毒素作用。大黃能增加腸蠕動、促進排便，有抗炎、抑菌、保肝利膽，改善血液循環(huán)，保護腸屏障功能調節(jié)免疫作用。其機理可能是全方發(fā)揮解熱、抑菌、抗炎、抗內(nèi)毒素、保肝、利膽、保護腸屏障功能調節(jié)免疫協(xié)同作用的結果。本實驗初步顯示，清毒提取液是治療膿毒癥的有效方法，能夠減輕腸黏膜損傷，減輕肝腎損傷，防止肝腎功能隨著膿毒癥的加重而進一步惡化。其更深入的作用機理有待進一步研究。

［1］ 曹書華.膿毒癥與多臟器功能失常綜合征［J］.中華急診醫(yī)學雜志，2010，19（7）：781-782.

［2］ 王慶，賴國祥，吳文燕.中西醫(yī)對膿毒癥發(fā)病機制的研究［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2007，16（20）：2940-2942.

［3］ 姚詠明，盛志勇.膿毒癥防治學［M］.北京：科學技術文獻出版社，2008：23-24.

［4］ 金水芳，江榮林，雷澍.黃芪注射液對膿毒癥大鼠腸道黏膜上皮細胞的保護作用及其機制研究［J］.浙江中醫(yī)藥大學學報，2015，39（6）：482-486.

［5］ 李志軍.“三證三法”及“菌毒炎并治”治療膿毒癥的研究進展［J］.中國中西醫(yī)結合外科雜志，2012，19（6）：321-323.

［6］ 唐彬，李云華，彭映輝，等.趙淳教授中西醫(yī)結合救治膿毒癥學術經(jīng)驗［J］.中國中醫(yī)急癥，2010，19（4）：362-364.

［7］ 蔡元坤，趙加應，任重，等.D-乳酸作為腸梗阻量化指標的實驗研究［J］.中華普通外科雜志，2007，22（6）：461-446.

［8］ Kanda T，Nakatomi Y，Ishikawa H，et al.Intestinal fatty acidbinding protein as a sensitive marker of intestinal ischemia［J］.Dig Dis Sci，1992，37（9）：1362-1367.

［9］ 潘莉雅，王新穎.脂肪酸結合蛋白在腸道疾病中的應用［J］.腸外與腸內(nèi)營養(yǎng)，2008，15（6）：369-371.

［10］趙保勝，劉永剛，王秀麗.黃連解毒湯解熱、抗炎作用研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2009，15（11）：55-57.

［11］戴錫珍，高淑娟.“黃連解毒湯”體外抗內(nèi)毒素作用的實驗研究［J］.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2006，6（5）：31-33.

［12］李學林，孟菲淺.析影響湯劑煎煮質量的因素［J］.中醫(yī)雜志，2006，36（6）：38-38.

［13］宋欠紅，樊睿，蘇玉杰，等.魚金葶顆粒對AECOPD模型大鼠血清 IL-8、TNF-α及 CRP的影響［J］.云南中醫(yī)學院學報，2016，39（2）：5-7.

［14］ 李忠仁.實驗針灸學［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：25-26.

［15］劉丹，劉晗喆，周秀華.烏斯他丁聯(lián)合參附注射液治療膿毒癥心肌損傷的療效分析［J］.醫(yī)學臨床研究，2015，25（9）：1685-1687.

［16］陸焱，邵耀明，陳文，等.小檗堿對膿毒癥小鼠血清高遷移率族蛋白B1水平的影響［J/CD］.中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2009，3（7）：1170-1173.

［17］金水芳，江榮林，雷澍，等.參附注射液對膿毒癥大鼠腸黏膜屏障功能的影響［J］.中醫(yī)雜志，2015，56（10）：877-880.

［18］楊文斌，馬世民，張秋錦.黃連的藥證及臨床應用［J］.中醫(yī)藥通報，2008，7（5）：35-37.

［19］趙保勝，劉永剛，王秀麗.黃連解毒湯解熱、抗炎作用研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2009，15（11）：55-57.

［20］周禎祥，唐德才.中藥學［M］.北京：中國中國醫(yī)藥出版社，2016：78-86，131.