程 雪 方 泓 指導(dǎo)吳銀根

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032）

肺纖維化是一種因多種原因引起的發(fā)病機(jī)制尚不明確的肺系疾病，好發(fā)生于老年人［1］，其中位生存期為2～5年［2］。因其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病程呈不可逆性進(jìn)展，早期診斷困難，目前尚無有效的臨床治療藥物。肺移植是目前治療晚期肺纖維化的唯一選擇，但其價(jià)格昂貴，供體稀少，不適合臨床應(yīng)用和推廣［3］。中醫(yī)古籍中沒有與肺纖維化相對(duì)應(yīng)的病名，現(xiàn)代醫(yī)家根據(jù)其臨床表現(xiàn)，將其歸為“肺痹”“肺痿”“肺脹”“咳嗽”等范疇。大量的臨床實(shí)踐表明，中醫(yī)藥在防治肺纖維化方面具有很大的優(yōu)勢(shì)［4］。導(dǎo)師吳銀根教授認(rèn)為本病的病機(jī)是肺絡(luò)痹阻，治療應(yīng)通補(bǔ)肺絡(luò)，并創(chuàng)立了肺痹方［5］。本研究擬通過觀察肺痹方對(duì)肺纖維化小鼠抗氧化作用的影響，初步探討其抑制肺纖維化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量8～20 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào) SCXK（京）2016-0011。

1.2 試藥與儀器 1）藥物：肺痹方組成三棱、法半夏、生地黃、女貞子，藥物飲片由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院提供，4 味藥物按照 1∶1∶1∶2 的比例，加入 8 倍劑量的水煎煮1 h后過濾，藥渣加入6倍的水煎煮1 h，過濾后，兩煎合并，濃縮至 1、2、4 g/mL，分裝后存放于4℃冰箱備用；吡非尼酮（北京康蒂尼藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20133376，規(guī)格每粒 100 mg）；注射用鹽酸博來霉素 （大連美侖生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：D1221A，每瓶 50 mg）。 2）試劑：羥脯氨酸（HYP）試劑盒（貨號(hào)：A030-1）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（貨號(hào)：A001-3）、還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒（貨號(hào)：A006-2）、丙二醛（MDA）試劑盒（貨號(hào)：A003-1）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。3）儀器：電熱恒溫水槽（DNB-501S，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9052，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），定軌振蕩器（VORTEX-5，海門市其林貝爾儀器制造有限公司），顯微鏡（403497，上海衡潔儀器有限公司），輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（RM2235，上海涵榮醫(yī)療器械有限公司），電子分析天平（BSA-124S，賽馬利斯科學(xué)儀器有限公司），酶標(biāo)儀（SynergyH1MF，美國(guó)伯騰儀器有限公司），4℃冰箱（BCD-312WDBA，青島海爾有限股份公司），-80℃冰箱（905-ults，賽墨飛世爾科技有限公司）。

1.3 分組及造模 60只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型組、吡非尼酮組、肺痹方低劑量組、肺痹方中劑量組、肺痹方高劑量組各10只。動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，室溫18～22℃，飼養(yǎng)常規(guī)觀察1周后使用。適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后第2日開始造模。模型組按 7.5 mg/（kg·d）腹腔注射鹽酸博來霉素［6］，連續(xù)注射10 d；空白對(duì)照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)注射10 d；其余各組造模方法同模型組。

1.4 給藥方法 造模后第2日，根據(jù)人與動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比值計(jì)算［7］，各組予不同濃度肺痹方進(jìn)行干預(yù)。低、中、高濃度劑量組分別按照人-鼠等效量的 1、2、4 倍給藥。吡非尼酮組按照 51.43 mg/（kg·d）的劑量給予吡非尼酮灌胃，肺痹方低、中、高劑量組分別按照 6.43、12.86、25.72 g/（kg·d） 的劑量予肺痹方灌胃，空白對(duì)照組及模型組給予等量的生理鹽水灌胃。給藥時(shí)間共28 d，每周稱取各組小鼠體質(zhì)量。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 用藥28 d后，采取眼球放血處死小鼠，繼之開胸，分離出小鼠的雙肺，肉眼觀察雙肺后，取小鼠雙肺，濾紙吸水稱重。肺系數(shù)=肺濕重/體質(zhì)量×100%。取左肺，固定于4%多聚甲醛溶液中，用于HE染色和Masson染色。肺組織病理切片根據(jù)Szapiel等［8］方法確定肺泡炎和肺纖維化的程度。取右肺中葉，在冰生理鹽水中充分漂洗后，用濾紙吸干表面水分，放入凍存管中，于-80℃冰箱中保存，用于測(cè)定肺組織勻漿中的HYP、SOD、GSH、MDA水平，按試劑盒說明書操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間檢驗(yàn)用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠一般行為及體質(zhì)量監(jiān)測(cè) 見表1。空白對(duì)照組活潑好動(dòng)，皮毛光亮潤(rùn)澤，呼吸平穩(wěn)，飲食如常，體質(zhì)量逐日增加，無特殊不良表現(xiàn)。其余各組小鼠在造模后1周內(nèi)，飲食和飲水量下降，小鼠精神不振，聚集成團(tuán)，呼吸急促，身體顫抖，毛發(fā)聳立、凌亂、脫落，缺乏光澤，體質(zhì)量逐日下降。21 d后各組小鼠的體質(zhì)量進(jìn)行性增加，除空白對(duì)照組外，其余各組仍有不同程度精神倦怠，呼吸喘促等癥狀。7 d時(shí)與空白對(duì)照組相比，各組小鼠體質(zhì)量均下降（P＜0.01）；吡非尼酮組、肺痹方高劑量組與模型組相比，小鼠體質(zhì)量下降明顯 （P＜0.05）。14 d時(shí)，除空白對(duì)照組外，各組小鼠體質(zhì)量仍逐漸下降（P＜0.01）；與肺痹方低、中、高劑量組相比，模型組小鼠體質(zhì)量下降最明顯 （P＜0.05或P＜0.01）；從21 d和28 d各小鼠的體質(zhì)量來看，各組小鼠的體質(zhì)量逐漸增加，但與正常組相比仍存在顯著差異 （P＜0.05）。

表1 各組小鼠體質(zhì)量、肺系數(shù)比較（±s）

表1 各組小鼠體質(zhì)量、肺系數(shù)比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對(duì)照組比較，△△P＜0.01。

體質(zhì)量（g）組 別 n 肺系數(shù)1 d 7 d 1 4 d 2 1 d 2 8 d空白對(duì)照組 1 0 2 2.9 7±0.8 9 2 4.4 1±1.1 6 2 5.7 8±1.2 9 2 6.6 2±1.6 6 2 7.7 1±1.7 8 0.9 5±0.3 3模型組 1 0吡非尼酮組 1 0 2 1.9 0±1.0 5 2 1.2 3±0.7 1△△ 1 9.0 9±0.7 7△△2 2.1 6±1.7 3 1 9.9 7±2.2 3△△*1 9.1 2±1.3 4△△2 0.6 1±2.3 7△△2 0.5 1±1.3 2△△2 1.7 5±1.9 7△△ 1.6 1±0.2 9△△2 2.3 3±1.0 9△△ 1.4 5±0.3 8△△肺痹方低劑量組 1 0 2 2.2 3±0.9 6 2 0.9 5±0.9 8△△ 2 0.2 8±0.9 4△△*2 0.9 8±1.3 9△△ 2 2.1 6±0.9 1△△ 1.5 1±0.2 9△△肺痹方中劑量組 1 0 2 2.4 3±0.8 6 2 0.6 9±1.0 9△△ 2 0.7 1±1.3 6△△**2 1.7 3±0.6 2△△ 2 2.4 2±1.5 1△△ 1.4 8±0.4 0△△肺痹方高劑量組 1 0 2 2.3 3±2.1 5 1 9.8 1±1.6 5△△*2 0.4 4±1.2 6△△*2 1.0 6±1.3 4△△ 2 2.5 7±1.3 7△△ 1.4 5±0.2 8△△

2.2 各組小鼠肺系數(shù)比較 見表1。與正常組相比，各組小鼠的肺系數(shù)明顯升高（P＜0.01），模型組小鼠的肺系數(shù)升高最明顯，但與用藥各組相比，無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 各組小鼠組織病理學(xué)觀察 見圖1~圖2，表2?？瞻讓?duì)照組小鼠肺內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔無增厚、纖維滲出，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)存在；模型組肺泡間隔及肺泡腔有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)消失，肺泡腔及肺泡間隔大量膠原纖維滲出，出現(xiàn)大片融合成團(tuán)的纖維灶。吡非尼酮組肺泡間隔增厚，炎癥細(xì)胞少量浸潤(rùn)，部分肺泡結(jié)構(gòu)存在，出現(xiàn)肺纖維灶。肺痹方低劑量組肺泡間隔及肺泡腔有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，大量膠原纖維滲出，但與模型組對(duì)比，稍減輕。肺痹方中、高劑量組肺泡結(jié)構(gòu)增寬，少量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)幾乎無明顯受損，少量肺纖維灶。

圖1 各組小鼠肺組織變化（HE染色，100倍）

圖2 各組小鼠肺組織變化（Masson染色，100倍）

表2 各組小鼠肺泡炎和肺纖維化程度比較（±s）

表2 各組小鼠肺泡炎和肺纖維化程度比較（±s）

組 別 n 肺泡炎級(jí)別 肺纖維化級(jí)別空白對(duì)照組 1 0 0 0模型組 1 0 ++～+++ ++～+++吡非尼酮組 1 0 +～++ +～++肺痹方低劑量組 1 0 +～+++ +～+++肺痹方中劑量組 1 0 0～++ +～++肺痹方高劑量組 1 0 0～++ 0～++

2.4 各組小鼠肺組織勻漿中HYP含量比較 見表3。各小鼠肺組織中HYP含量，模型組最高，高于其余各組。除肺痹方低劑量組外，模型組與其他各組相比，具有顯著差異（P＜0.01）；與空白對(duì)照組相比，其余各組小鼠肺組織中HYP含量明顯升高（P＜0.01）；吡非尼酮組小鼠組織中HYP的含量與肺痹方各組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；肺痹方低劑量組小鼠肺組織中HYP含量明顯高于肺痹方高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組小鼠肺組織勻漿中HYP、SOD、GSH、MDA含量比較（±s）

表3 各組小鼠肺組織勻漿中HYP、SOD、GSH、MDA含量比較（±s）

與空白對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01； 與模型組比較，##P＜0.01；與肺痹方低劑量組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 n空白對(duì)照組 1 0模型組 1 0吡非尼酮組 1 0 H Y P（μ g/m g） S O D（U/m g） G S H（μ m o l/g） M D A（n m o l/m g）0.8 5±0.5 7**## 1 2 2.0 9±7.1 0**## 4 8.1 8±5.3 3**## 0.5 8±0.2 0##1.8 6±0.3 2△△ 7 1.1 1±5.3 7△△** 2 6.5 2±5.6 4△△** 1.5 0±0.3 6△△1.4 2±0.4 2△△##1 0 0.3 6±4.1 9△△##* 3 9.2 1±2.0 6△△##* 0.9 1±0.0 9##肺痹方低劑量組 1 0 1.6 8±0.3 3△△ 8 7.5 6±6.9 7△△## 3 4.5 5±1.3 3△△## 1.1 2±0.2 0△#肺痹方中劑量組 1 0 1.4 5±0.3 4△△## 9 8.8 4±5.2 9△△##* 3 9.4 4±1.6 4△△##* 0.9 1±0.3 8##肺痹方高劑量組 1 0 1.3 5±0.2 8△△##*1 0 3.8 2±4.5 9△△##** 3 9.2 1±2.4 3△△##* 0.8 0±0.2 9##

2.5 各組小鼠肺組織勻漿中SOD、GSH、MDA含量比較 見表3?？瞻讓?duì)照組小鼠肺組織SOD、GSH含量均高于其余各組 （P＜0.01）；模型組小鼠肺組織SOD、GSH含量最低（P＜0.01）；用藥各組相比較，肺痹方低劑量組小鼠肺組織SOD、GSH含量均低于吡非尼酮組、肺痹方中劑量組、肺痹方高劑量組（P＜0.05或P＜0.01）?？瞻讓?duì)照組小鼠肺組織MDA含量低于其他各組，與模型組、肺痹方低劑量組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與吡非尼酮組、肺痹方中劑量組、肺痹方高劑量組相比，無顯著差異（P＞0.05）；模型組小鼠肺組織MDA含量最高，與其余各組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

3 討 論

肺纖維化是一種導(dǎo)致肺功能進(jìn)行性喪失的嚴(yán)重的肺間質(zhì)性疾病［9］。其發(fā)病機(jī)制尚不明確，有研究表明，肺纖維化與異常相關(guān)的多個(gè)生物途徑有關(guān)，如凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)、氧化-抗氧化途徑、細(xì)胞凋亡、血管重生和重建［10］。近研究表明，機(jī)體氧化/抗氧化的失衡啟動(dòng)了肺泡炎的發(fā)生，引起中性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，這樣一方面加重了氧化損傷，另一方面釋放各種成纖維化細(xì)胞因子，刺激形成肺纖維化［11］。而多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，肺纖維化形成過程中存在過度或抗氧化不足的現(xiàn)象。

到目前為止，臨床上沒有有效的藥物治療此病，肺移植是徹底治療肺纖維化終末期的唯一有效手段［12］，但由于供體稀少，且價(jià)格昂貴，不利于臨床上應(yīng)用和推廣。吡非尼酮是一種口服生物可利用的人工合成分子，具有抗炎和抗纖維化作用［13］，2008年首先在日本得到獲批應(yīng)用于臨床治療。吡非尼酮雖然在一定程度上減緩疾病的進(jìn)展，但抗纖維化的作用不甚理想，且相伴的副作用不容忽視［14-15］。肺痹方是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院吳銀根教授治療肺纖維化的經(jīng)驗(yàn)方，前期臨床研究表明，肺痹方能夠改善患者胸悶、氣短、喘咳等癥狀，提高患者的生存質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)觀察肺痹方對(duì)肺纖維化小鼠抗氧化作用的影響，發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化作用，能延緩肺纖維化進(jìn)展。

本研究采用連續(xù)10 d腹腔注射博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化形成，而博來霉素是一種具有細(xì)胞毒性的氨基糖肽類抗腫瘤抗生素復(fù)合物，其主要的副作用是肺纖維化［16］。從研究的結(jié)果看，吡非尼酮組、肺痹方低、中、高劑量組不同程度降低了小鼠的肺系數(shù)，而且隨著用藥天數(shù)的增加，小鼠的體質(zhì)量也逐漸增加，說明上述藥物不同程度的改善了小鼠肺纖維化形成，提高了肺纖維化小鼠的生存率。HYP為膠原纖維特有，能反映肺纖維化程度。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒MHYP的含量明顯高于其余各組，肺痹方低劑量組小鼠肺組織中HYP含量明顯高于肺痹方高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示用藥組能夠減少肺纖維化小鼠肺組織中HYP的過度沉積，且肺痹方高劑量效果優(yōu)于低劑量。

從肺痹方對(duì)肺纖維化抗氧化作用來看，模型組小鼠SOD、GSH含量最低，肺痹方低劑量組小鼠肺組織中SOD、GSH含量均低于吡非尼酮組、肺痹方中劑量組、肺痹方高劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而模型組小鼠肺組織中MDA含量最高，與其余各組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明吡非尼酮組和肺痹方低、中、高劑量組對(duì)肺纖維化小鼠肺組織中抗氧化作用有一定意義。且從上述結(jié)果來看，肺痹方高劑量組明顯優(yōu)于其他各組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肺痹方可以抗氧化、抗自由基損傷，減少肺纖維蛋白形成，從而達(dá)到抗纖維化的作用。

肺纖維化病因病機(jī)復(fù)雜，吳銀根教授認(rèn)為本病為“肺絡(luò)阻痹”，而本病之“本”應(yīng)視為肺腎氣虛，通補(bǔ)肺絡(luò)是其治則［17］，因此創(chuàng)立了肺痹方（三棱、法半夏、生地黃、女貞子），三棱為活血化瘀藥，吳老認(rèn)為對(duì)于肺絡(luò)阻痹之瘀血，非三棱、莪術(shù)等破血之品不為功，但是化血之力三棱優(yōu)于莪術(shù)。法半夏能燥濕化痰，消痞散結(jié)。地黃，《本經(jīng)逢原》“干地黃，內(nèi)專涼血滋陰，外潤(rùn)皮膚榮澤，病人虛而有熱者宜加用之”。女貞子具有滋補(bǔ)肝腎，烏須明目的作用?，F(xiàn)代藥理表明，女貞子具有抗炎、抗氧化作用［18］。此方根據(jù)臨床辨證組方，用藥合理，以求達(dá)到治病求本之效。

綜上所述，肺痹方能夠抑制肺纖維化小鼠肺組織中氧化/抗氧化系統(tǒng)的平衡，減少氧自由基對(duì)肺組織結(jié)構(gòu)的氧化損傷程度，抑制肺組織膠原蛋白的合成，從而達(dá)到抗肺纖維化的程度。

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