王樹文，李 濤，林鴻程，楊 豐，林榮文△，陳遠壽

(1.廣東醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院，廣東東莞 523808；2.遵義醫(yī)學院生理教研室，貴州遵義 563099)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種由多種病因引起的慢性非傳染性疾病，其患病率呈逐年遞增趨勢，已對全球居民的健康造成嚴重影響[1]。據國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)最新數據顯示，2014年全球糖尿病估測患者達到3.87億，其中2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)占90%以上[2]。隨著DM死亡人數及醫(yī)療費用支出的不斷增加，DM疾病的負擔已日趨嚴重。然而，DM具體的發(fā)病機制至今仍未完全明確，這給臨床診治帶來很大困難。因此，深入研究DM發(fā)病機制對預防DM及提高其治療效果具有重要意義。據報道，T2DM的發(fā)生、發(fā)展與胰島素的分泌密切相關，囊泡谷氨酸轉運子2(vesicular glutamate transporter 2，VGLUT2)轉運谷氨酸進入胰島素分泌囊泡的過程是胰島素分泌的限速步驟[3-4]。由于胰島素是臨床上治療DM的首選，所以對于胰島素分泌機制的深入研究有利于對DM發(fā)病機制的理解。

本實驗以大鼠胰島β細胞RIN-5F作為研究對象，從胰島素對VGLUT2基因表達調控入手，通過Real-time qPCR、Western blot、siRNA干擾等方法，觀察胰島素對VGLUT2的mRNA及蛋白表達水平的影響，闡明胰島素信號通路中胰島素受體(insulin receptor，IR)、胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS)與VGLUT2表達之間的關系，以期為明確DM的發(fā)生機制提供線索。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞 RIN-5F由上海生科院細胞庫提供。

1.1.2試劑 羊抗鼠VGLUT2多克隆抗體(美國Sigma公司)；胰島素、胎牛血清(美國Gibco公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒，一抗、二抗稀釋液(碧云天生物科技研究所)；IgG-辣根過氧化物酶(HRP)、IR siRNA、IRS-1 siRNA、IRS-2 siRNA、siRNA Transfection Medium、Control siRNA、siRNA Transfection Reagent(廣州銳博奧公司)；LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)。

1.1.3儀器 7500定量PCR儀(美國ABI公司)；成像儀、電泳槽(美國Bio7Rad公司)；ND-1000微量核酸蛋白檢測儀(美國Nanodrop公司)。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)RIN-5F (1)RIN-5F的復蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存按照文獻[5]報道方法操作。(2)細胞計數：吸取10 μL細胞懸液滴于蓋片與計數板間，靜置，然后鏡下計算細胞總數。細胞數/mL=4大格細胞總數/4×104。

1.2.2處理RIN-5F (1)以1 mmol/L胰島素為母液，配制不同濃度(0、50、100、200、500、1 000 nmol/L)胰島素各15 mL；(2) 大鼠胰島β細胞RIN-5F分裝至6個培養(yǎng)皿及1個6孔板中；(3)用以上6種濃度胰島素分別處理RIN-5F 30 h。

1.2.3實驗分組及RNA干擾實驗 首批分組為：空白組(Blank組)、LipofectamineTM2000組(Lip2000組)、Control-siRNA組、IR-siRNA組。第2批分組為：Blank組、Lip2000組、Control-siRNA組、IRS1-siRNA組及IRS2-siRNA組。根據設計組別分裝RIN-5F至相應的培養(yǎng)皿和6孔板中，然后用不同的siRNAs處理RIN-5F。

1.2.4蛋白質的提取 收取細胞(6個培養(yǎng)皿)，PBS洗1遍，加入RIPA細胞裂解液裂解，12 000 r/min離心30 min后取上清液即為RIN-5F的總蛋白樣品，然后以BCA法測定蛋白質濃度。于樣品中加入5×十二烷基硫酸鈉(SDS)蛋白上樣緩沖液(V/V=4∶1)，水浴(100 ℃)10 min后立即置于冰中直至其完全冷卻，最后按每孔5 μg蛋白量上樣。

1.2.5總RNA的提取 按Invitrogen操作說明Trizol 法提取樣品總RNA；RNA用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性[6]。吸取1 μL RNA溶液樣品，測定(用NanoDrop分光光度計)260 nm及280 nm的吸光度(A)值，得到RNA濃度。RNA的A260/A280比值必須在1.8～2.0。分裝樣品(以20 μL為最小單位)，保存(-86 ℃，1年內有效)。

1.2.6VGLUT2蛋白的測定 采用Western blot法，以β-actin為內參，洗膜結束立刻配制電化學發(fā)光(ECL)顯影液，接著浸泡PVDF膜5 min，然后曝光顯影(用成像系統(tǒng))得出圖片，通過BandScan 圖像分析的軟件來分析其光密度值，并計算出VGLUT2的相對含量。

1.2.7PCR引物設計 引物經Shanghai biological engineering company合成：VGLUT2上游引物5′-AGA AGG CTC CGC TAT GCG ACT G-3′，下游引物5′-ATC CTC CTG GAA TCT GGG TGA TG-3′，擴增片斷長度351 bp;內參β-actin上游引物5′-TCA TGA AGT GTG ACG TTG ACA TCC GT-3′，下游引物5′-CTT AGA AGC ATT TGC GGT GCA CGA TG-3′，擴增片斷長度267 bp。

1.2.8Real-time qPCR 每組4個樣品cDNA，每個重復進行3個平行實驗，參照Takara的One Step SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒說明書進行反應[7]。通過v 1.4 SDS軟件分析所得數據。

2 結 果

2.1不同濃度胰島素對VGLUT2 mRNA和蛋白表達的影響 胰島素濃度為100、200 nmol/L時VGLUT2 mRNA及蛋白表達均受到明顯抑制(P<0.05)，并且在100 nmol/L時所受抑制最明顯，見圖1、2。

圖1 不同濃度胰島素對VGLUT2 mRNA表達的影響

圖2 不同濃度胰島素對VGLUT2蛋白表達的影響

2.2100 nmol/L胰島素在不同時間點對VGLUT2的mRNA和蛋白表達的調節(jié) 與0 h比較， VGLUT2 mRNA和蛋白表達在12、18、24 h均受到明顯抑制(P<0.05)，其中在12 h時mRNA表達受抑制最為明顯，在24 h時蛋白表達受抑制最為明顯，見圖3、4。

圖3 100 nmol/L胰島素在不同時間點對VGLUT2 mRNA表達的影響

圖4 100 nmol/L胰島素在不同時間點對VGLUT2 蛋白表達的影響

2.3胰島素信號通路的IR及IRS對VGLUT2表達的影響

2.3.1IR-siRNA干擾對IR mRNA表達的影響 與Blank組、Lip2000組、Control-siRNA組比較，IR-siRNA組IR mRNA表達受到明顯抑制(P<0.05)，見圖5。

2.3.2IRS1-siRNA及IRS2-siRNA干擾對IRS1、IRS2 mRNA表達的影響 IRS1-siRNA組及IRS2-siRNA組與Blank組、Lip2000組及Control-siRNA組比較，IRS1、IRS2的mRNA表達均受到明顯抑制(P<0.05)，見圖6。

圖5 IR-siRNA干擾對RIN-5F細胞的IR mRNA表達的影響

圖6 IRS1-siRNA和IRS2-siRNA干擾對IRS1和IRS2 mRNA表達的影響

2.3.3IR-siRNA干擾對100 nmol/L胰島素抑制VGLUT2 mRNA和蛋白表達的影響 與Blank組、Lip2000組及Control-siRNA組比較，IR-siRNA組VGLUT2 mRNA和蛋白表達明顯上調(P<0.05)，見圖7、8。

圖9 IRS1/IRS2-siRNA干擾對100 nmol/L胰島素抑制VGLUT2 mRNA表達的影響

2.3.4IRS1/IRS2-siRNA干擾對100 nmol/L胰島素抑制VGLUT2 mRNA和蛋白表達的影響 與Blank組、Lip2000組及Control-siRNA組比較，IRS1-siRNA及IRS2-siRNA組VGLUT2 mRNA和蛋白表達明顯上調(P<0.05)，見圖9、10。

圖10 IRS1/IRS2-siRNA干擾對100 nmol/L胰島素抑制VGLUT2蛋白表達的影響

3 討 論

胰島素抵抗和胰島素代償性分泌不足會導致T2DM的發(fā)生。明確胰島素的分泌機制將有助于對DM病因的理解。在胰腺細胞分泌胰島素的過程中，谷氨酸向分泌囊泡中的轉運由VGLUT2完成，經過這種逆濃度梯度的轉運造成的分泌囊泡內外的谷氨酸濃度差是驅動分泌囊泡向細胞膜運動的主要動力，這一步驟也是胰島素分泌的限速步驟[8]。VGLUT2的基因表達受葡萄糖濃度的調控[9]，由于胰島素是治療DM的首選，那么這種外源的胰島素對于患者胰島功能的影響是什么，目前尚不清楚。

從本實驗的結果可以得知，在無糖條件下，胰島素在特定濃度和時間點均可明顯下調VGLUT2 mRNA和蛋白表達，并且其最佳濃度為100 nmol/L，最佳作用時間點為12 h(mRNA水平)和24 h(蛋白質水平)。

利用IR-siRNA、IRS1-siRNA及IRS2-siRNA分別干擾RIN-5F后，100 nmol/L胰島素對VGLUT2基因表達的抑制明顯下降。據此可以推斷，在該過程中IR、IRS1及IRS2 3種參與因子發(fā)揮了重要作用。研究表明，胰島素與IR結合后能夠激活胰島素信號通路，從而調控細胞的分化、增殖、生存及代謝[10-11]。IRS亦具有連接胰島素信號通路中IR的功能，并且在胰島素抵抗過程中起著舉足輕重的作用[12-13]。有報道顯示，IRS1和IRS2能夠通過不同途徑對胰島素信號傳導通路進行反饋調控進而影響胰島素的分泌[14]。另外，胰島素信號通路受阻，則會造成胰島β細胞功能損傷和外周胰島素抵抗；但值得注意的是，在T2DM發(fā)病初期，胰腺尚能通過代償功能刺激胰島素產生和分泌的增加，維持血糖的穩(wěn)定，患者此時并未出現(xiàn)DM的臨床癥狀；隨著病情的進一步發(fā)展，胰腺最終會喪失代償功能而導致T2DM的發(fā)生[15-18]。以上研究表明，在胰島素信號通路中，VGLUT2基因是通過IR、IRS1、IRS2這3種參與因子對胰島素的分泌進行了反饋調控。

綜上所述，本實驗明確了胰島素對VGLUT2基因表達進行反饋調控的信號通路及其信號通路中參與因子(IR、IRS1、IRS2)的功能，闡明了胰島素、VGLUT2基因及參與因子之間的關系，這將為DM發(fā)病機制的理論研究提供新的參考和為臨床診治DM提供新的思路。

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