張 旭，陳旺盛，張夢(mèng)嬌，聶 嬌，陳 秀△

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院:1.老年病科;2.胃腸外科，四川瀘州 646000)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是指由于持續(xù)高血糖水平所致心臟微血管病變、心肌代謝紊亂及心肌細(xì)胞纖維化等病變，導(dǎo)致的心肌結(jié)構(gòu)發(fā)生廣泛改變，最終引起左心室肥厚、心臟泵血功能障礙的一種疾病狀態(tài)[1-3]。多項(xiàng)研究提示，在糖尿病動(dòng)物模型和糖尿病患者中均存在心肌細(xì)胞凋亡增加、生存力降低[4-5]，但其機(jī)制目前仍報(bào)道甚少。鳥苷酸交換因子C3G參與多種細(xì)胞在不同病理?xiàng)l件下的增殖分化與凋亡[6-7]，筆者前期研究發(fā)現(xiàn)C3G在心肌缺血、缺氧損傷模型中對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用[8]，但其對(duì)高糖誘導(dǎo)環(huán)境下心肌細(xì)胞的作用目前暫無報(bào)道。本研究探討過表達(dá)C3G對(duì)高糖誘導(dǎo)下H9C2心肌細(xì)胞的增殖率、凋亡率的影響，以期為DCM的防治尋找新的思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 大鼠H9C2心肌細(xì)胞株購自中科院上海生命科學(xué)研究院；DMEM培養(yǎng)基、D-葡萄糖、胎牛血清(FBS) 購自美國 Gibco 公司；pCXN2-Flag、pCXN2-Flag-hC3G質(zhì)粒由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科令狐華教授惠贈(zèng)；質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體LTX 和Plus購自美國Invitrogen公司；小鼠抗大鼠β-actin抗體 (sc-47778)、兔抗大鼠及人C3G抗體 (sc-15359) 購自美國Santa Cruz公司；細(xì)胞凋亡試劑盒 (Annexin V-FITC、PI) 購自江蘇碧云天生物研究所；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)方法及分組 H9C2心肌細(xì)胞在含10% FBS的低糖(5 mmol/L) DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分別接種于6個(gè)直徑10 cm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度達(dá)60%左右時(shí)分別用空白試劑、空質(zhì)粒、人過表達(dá)C3G質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞，將細(xì)胞標(biāo)記為空白組、空載體組、過表達(dá)C3G組3組，每組2份，培養(yǎng)9 h后重新消化細(xì)胞、細(xì)胞計(jì)數(shù)，從以上3組中分別取相同細(xì)胞，接種于6個(gè)平板中(Western blot用培養(yǎng)皿，MTT用96孔平板，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)用6孔板)，低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h讓其充分貼壁后將其中一份培養(yǎng)基置換為含10% 胎牛血清的5.5 mmol/L的 D-葡萄糖培養(yǎng)基，另一份培養(yǎng)基置換為含10% 胎牛血清的33.3 mmol/L的 D-葡萄糖培養(yǎng)基(此時(shí)設(shè)置為實(shí)驗(yàn)的0點(diǎn))，培養(yǎng)72 h(此時(shí)設(shè)置為實(shí)驗(yàn)的72點(diǎn))，將細(xì)胞分為空白組、空載體組、過表達(dá)C3G組、空白+高糖組、空載體+高糖組、過表達(dá)C3G+高糖組。

1.2.2Western blot檢測(cè)C3G蛋白相對(duì)表達(dá)水平 分別提取6組細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯胺分離凝膠(SDS-PAGE)，每組分別上樣20 μg蛋白，電泳分離后電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，4%牛奶37 ℃封閉2 h后，一抗孵育8 h以上，洗膜，孵育二抗，洗膜，最后通過 ECL發(fā)光試劑盒顯影成像，進(jìn)行吸光度值定量分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用Quantity-One軟件分析各組C3G蛋白的相對(duì)表達(dá)量，C3G 蛋白相對(duì)表達(dá)量用C3G吸光度值/β-actin吸光度值表示。

1.2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 分別檢測(cè)各組0點(diǎn)、72點(diǎn)細(xì)胞的吸光度值，在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)取相同細(xì)胞數(shù)加MTT液20 μL (5 mg/mL),4 h后棄液，加200 μL二甲基亞砜(DMSO)，37 ℃搖床培養(yǎng)30 min，酶標(biāo)儀(570 nm波長(zhǎng))測(cè)定吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖率(%)= (72點(diǎn)吸光度值-0點(diǎn)吸光度值)/0點(diǎn)吸光度值。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 分別檢測(cè)各組72 點(diǎn)的凋亡率。收集細(xì)胞，將其懸浮后加入Annexin V-FITC、PI后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1各組H9C2心肌細(xì)胞C3G蛋白表達(dá) 較空白組(0.764±0.223)、空載體組(0.666±0.200)，過表達(dá)C3G組(1.233±0.340)的C3G蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)。較空白+高糖組(0.262±0.082)、空載體+高糖組(0.249±0.074)，過表達(dá)C3G+高糖組(0.646±0.217)的C3G蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)，見圖1。

A:空白組；B:空載體組；C:過表達(dá)C3G組；D:空白+高糖組；E:空載體+高糖組；F:過表達(dá)C3G+高糖組

圖1各組H9C2心肌細(xì)胞C3G蛋白表達(dá)

2.2各組H9C2心肌細(xì)胞增殖率 較空白組、空載體組,空白+高糖組、空載體+高糖組的增殖率均明顯降低(P<0.05)；過表達(dá)C3G組的增殖率較空白組、空載體組明顯升高(P<0.05)；較空白+高糖組、空載體+高糖組，過表達(dá)C3G+高糖組的增殖率顯著升高(P<0.05)，見圖2、表1。

A:空白組；B:空載體組；C:過表達(dá)C3G組；D:空白+高糖組；E:空載體+高糖組；F:過表達(dá)C3G+高糖組

圖2各組H9C2心肌細(xì)胞的增殖率

2.3各組H9C2心肌細(xì)胞凋亡率 較空白組、空載體組,空白+高糖組、空載體+高糖組凋亡率明顯升高(P<0.05)；過表達(dá)C3G組的凋亡率較空白組、空載體組明顯降低(P<0.05)；較空白+高糖組、空載體+高糖組，過表達(dá)C3G+高糖組的凋亡率明顯降低(P<0.05)，見圖3、表1。

A:空白組；B:空載體組；C:過表達(dá)C3G組；D:空白+高糖組；E:空載體+高糖組；F:過表達(dá)C3G+高糖組

圖3 各組H9C2心肌細(xì)胞的凋亡率

3 討 論

心肌細(xì)胞的凋亡增加、生存力降低是許多心血管疾病發(fā)病的重要特點(diǎn)之一[9-10]。研究表明，糖尿病患者中心肌細(xì)胞的廣泛凋亡、變性與壞死等心肌結(jié)構(gòu)的改變，嚴(yán)重降低了心臟在應(yīng)對(duì)各種損傷時(shí)的代償能力，導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)與泵血功能障礙[11-12]。心肌細(xì)胞凋亡在DCM發(fā)病過程中起著重要作用，DCM中的心肌細(xì)胞更易發(fā)生壞死、凋亡。

整合素信號(hào)通路家族，如整合素的β1、β3 亞基及其下游的焦點(diǎn)黏附激酶(FAK)、整合素連接激酶(ILK)等具有促進(jìn)心肌細(xì)胞存活、抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用。完全敲除FAK可導(dǎo)致小鼠在胚胎期死亡，而主要原因可能與心血管系統(tǒng)發(fā)育缺陷有關(guān)，過表達(dá)ILK可促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖、存活，抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善心肌梗死后心臟重塑[2,13-15]。C3G作為其重要成員之一，主要參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖、凋亡等細(xì)胞行為，在心肌細(xì)胞及神經(jīng)系統(tǒng)胚胎發(fā)育中起著必不可少的作用[6,16]，然而，在DCM心肌細(xì)胞中的作用卻鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，C3G在H9C2心肌細(xì)胞中存在表達(dá)；過表達(dá)C3G可使H9C2心肌細(xì)胞中C3G蛋白表達(dá)量明顯增加，可明顯降低心肌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖、存活；經(jīng)過高糖處理后，心肌細(xì)胞出現(xiàn)大量壞死、凋亡，細(xì)胞凋亡率明顯升高，細(xì)胞增殖率明顯降低，而這種現(xiàn)象經(jīng)過轉(zhuǎn)染過表達(dá)C3G后得以改善。由此可以證實(shí)，過表達(dá)C3G可以提高高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞的生存力，對(duì)研究DCM的治療有一定理論意義。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在高糖+空白組、高糖+空載體組的C3G蛋白表達(dá)較空白組、空載體組明顯減少，說明高糖環(huán)境并不能直接促進(jìn)心肌細(xì)胞自身的C3G蛋白表達(dá)；而在過表達(dá)C3G+高糖組，其C3G蛋白表達(dá)、心肌細(xì)胞增殖率、凋亡率較高糖+空白組、高糖+空載體組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其機(jī)制可能與轉(zhuǎn)染后C3G在心肌細(xì)胞中的表達(dá)明顯增加或者與過表達(dá)C3G能夠激活或抑制其心肌細(xì)胞的某些信號(hào)分子有關(guān)，但C3G能夠抑制高糖環(huán)境中的心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖存活的機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究結(jié)果證實(shí)，高糖環(huán)境能明顯抑制心肌細(xì)胞增殖、促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。過表達(dá)C3G可以提高H9C2心肌細(xì)胞的生存力，逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境對(duì)心肌細(xì)胞所造成的不良影響。本研究為過表達(dá)C3G保護(hù)糖尿病引起的心肌損傷提供了理論依據(jù)，隨著研究的深入，C3G在糖尿病心肌病中的作用及其相關(guān)聯(lián)的信號(hào)通路也將進(jìn)一步被明確。C3G有望成為探索DCM發(fā)病機(jī)制的新靶點(diǎn)。

[1]XU Z,SUN J,TONG Q,et al.The Role of ERK1/2 in the Development of Diabetic Cardiomyopathy[J].Int J Mol Sci,2016,17(12):156-160.

[2]WESTERMEIER F,RIQUELME J A,PAVEZ M,et al.New molecular insights of insulin in diabetic cardiomyopathy[J].Front Physiol,2016,7:125.

[3]CHEN J,ZHANG Z,CAI L.Diabetic cardiomyopathy and its prevention by nrf2:current status[J].Diabetes Metab J,2014,38(5):337-345.

[4]TSYPLENKOVA VG.Cardiomyocytic dedifferentiation,“hibernation”,and apoptosis are possible factors of progressive diabetic cardiomyopathy[J].Arkh Patol,2009,71(4):30-33.

[5]HUYNH K,BERNARDO B C,MCMULLEN J R,et al.Diabetic cardiomyopathy:mechanisms and new treatment strategies targeting antioxidant signaling pathways[J].Pharmacol Ther,2014,142(3):375-415.

[6]WANG L,LI G,WANG Z,et al.Elevated expression of C3G protein in the peri-infarct myocardium of rats[J].Med Sci Monit Basic Res,2013,19:1-5.

[7]ARAI A,NOSAKA Y,KANDA E,et al.Rap1 is activated by erythropoietin or interleukin-3 and is involved in regulation of beta1 integrin-mediated hematopoietic cell adhesion[J].J Biol Chem,2001,276(13):10453-10462.

[8]楊東艷,李剛,張蕾,等.C3G基因?qū)9C2心肌細(xì)胞凋亡和增殖的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2015,40(8):603-609.

[9]HUBY A C,TURDI S,JAMES J,et al.FasL expression in cardiomyocytes activates the ERK1/2 pathway,leading to dilated cardiomyopathy and advanced heart failure[J].Clin Sci (Lond),2016,130(4):289-299.

[10]PRESCIMONE T,MASOTTI S,D′AMICO A,et al.Cardiac molecular markers of programmed cell death are activated in end-stage heart failure patients supported by left ventricular assist device[J].Cardiovasc Pathol,2014,23(5):272-282.

[11]WANG S,DING L,JI H,et al.The Role of p38 MAPK in the development of diabetic cardiomyopathy[J].Int J Mol Sci,2016,17(7):842-850.

[12]DELBRIDGE L M,BENSON V L,RITCHIE R H,et al.Diabetic cardiomyopathy:the case for a role of fructose in disease etiology[J].Diabetes,2016,65(12):3521-3528.

[13]FAN D,TAKAWALE A,SHEN M,et al.A Disintegrin and metalloprotease-17 regulates pressure overload-induced myocardial hypertrophy and dysfunction through proteolytic processing of integrin β1[J].Hypertension,2016,68(4):937-948.

[14]BAI J,GU R,WANG B,et al.Overexpression of integrin-linked kinase improves cardiac function in a rat model of doxorubicin-induced chronic heart failure[J].Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi,2014,42(3):225-229.

[15]ELMEKKAWI S F,MANSOUR G M,ELSAFTY M S,et al.Prediction of fetal hypertrophic cardiomyopathy in diabetic pregnancies compared with postnatal outcome[J].Clin Med Insights Womens Health,2015,8:39-43.

[16]RADHA V,MITRA A,DAYMA K,et al.Signalling to actin:role of C3G,a multitasking guanine-nucleotide-exchange factor[J].Biosci Rep,2011,31(4):231-244.