郭 宇，徐靜舒，戴青原，譚小兵△

(1.云南省第一人民醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，昆明 650032；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，昆明 650032)

最近研究發(fā)現(xiàn)特定轉(zhuǎn)錄基因可使終末分化體細(xì)胞重新獲得干細(xì)胞特性，命名為誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)[1-2]，iPSCs無論在形態(tài)和功能等方面均與胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)非常相似，是近年來干細(xì)胞領(lǐng)域的重要里程碑[3]。iPSCs技術(shù)可產(chǎn)生患者特異性干細(xì)胞用于疾病模型研究和細(xì)胞治療，為個(gè)性化治療打下了基礎(chǔ)[4]。

iPSCs要應(yīng)用于臨床治療就必須保持原有基因完整性，不能攜帶任何外源性病毒或基因。目前許多方法均可產(chǎn)生iPSCs，包括腺病毒、游離型載體、質(zhì)粒，合成mRNA、miRNAs等，但都存在一定缺陷，如重編程效率低下、程序繁瑣等[5]。筆者的前期研究也將人牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells,DPSCs)和根尖乳頭干細(xì)胞(stem cells from apical papilla，SCAP)重編程為iPSCs[6-7]，但iPSCs攜帶有致瘤基因，且誘導(dǎo)效率不高，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。

為建立更高效、更安全的重編程方法，本研究采用一種新型RNA載體(仙臺(tái)病毒)將人DPSCs和SCAP重編程為iPSCs，比較兩種iPSCs的克隆形態(tài)、誘導(dǎo)效率、誘導(dǎo)時(shí)間等生物學(xué)特性，為iPSCs用于干細(xì)胞治療提供更理想的細(xì)胞來源。

1 材料與方法

1.1主要試劑 α-MEM(minimum essential medium)培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)購自美國Gibco公司；Ⅰ型膠原酶、中性蛋白酶購自美國Roche公司；基質(zhì)膠(Matrigel，生長因子減少型)購自美國BD公司；TriZOL總RNA提取試劑盒、 SuperScript?Ⅲ Ofne-Step RT-PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；CytoTune?-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit試劑盒購自美國Life公司；重編程培養(yǎng)基、PSC-easy iPS細(xì)胞培養(yǎng)基、基質(zhì)膠、人胚胎干細(xì)胞(H9)購自北京賽貝生物科技公司。

1.2方法

1.2.1分離培養(yǎng) 收集云南省第一人民醫(yī)院口腔頜面外科2017年1月拔除的年輕患者下頜第3磨牙。采用BAKKAR等[8]方法進(jìn)行培養(yǎng)：收集牙髓、根尖乳頭組織，充分剪碎，37 ℃、Ⅰ型膠原酶/中性蛋白酶(3∶4 mg/mL)消化60 min，過細(xì)胞濾器(70 μm直徑)得到單細(xì)胞懸液，加入完全培養(yǎng)基(α-MEM+15%FBS+1%谷氨酰胺+1%青/鏈霉素)，37 ℃、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)、傳代，第3～5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)云南省第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2013YL023)并取得患者書面同意。

1.2.2重編程 嚴(yán)格按照Sendai Reprogramming Kit試劑盒進(jìn)行操作，底物為基質(zhì)膠(終濃度50 μg/mL)，人H9為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。轉(zhuǎn)染前2 d：6孔板常規(guī)培養(yǎng)人DPSCs和SCAP(第3代，每孔1×105)，轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞70%融合。轉(zhuǎn)染當(dāng)天(第0天)將適量SeV溶解到70 μL完全培養(yǎng)基，加入6孔板，1 d后(第1天)再加入130 μL完全培養(yǎng)基，第2天換新鮮培養(yǎng)液(含SeV)繼續(xù)轉(zhuǎn)染。第3天收集已轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到基質(zhì)膠覆蓋6孔板，重編程培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，3周左右可觀察到小克隆出現(xiàn)?？寺〕墒鞎r(shí)，“十字分割法”分離克隆，轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)板(基質(zhì)膠覆蓋)，PSC-easy培養(yǎng)基(含10 μmol/L Y27632)培養(yǎng)。SeV重編程過程見圖1。

圖1 仙臺(tái)病毒重編程簡圖

1.2.3兩種牙源性iPSCs克隆形態(tài)、重編程時(shí)間、重編程效率 克隆形態(tài)：觀察iPSCs在不同體系底物上的生長情況(人H9為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照)；重編程時(shí)間：計(jì)算從接種開始到ES樣克隆出現(xiàn)的時(shí)間，即為該克隆形成時(shí)間(誘導(dǎo)時(shí)間)，重復(fù)3次，取平均值；重編程效率：確定精確的重編程效率非常復(fù)雜，出現(xiàn)克隆數(shù)占重編程體細(xì)胞數(shù)量的比例是一個(gè)重要參數(shù)。計(jì)算公式：克隆數(shù)/體細(xì)胞數(shù)量×100%，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 收集兩種牙源性iPSCs(第12代，5×106個(gè))，TriZOL試劑盒提取總RNA，取1 μL RNA，NanoDrop 2000分光光度機(jī)(美國Thermo公司)測量濃度，嚴(yán)格按照一步法RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件：反轉(zhuǎn)錄45 ℃ 30 min；PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min，35次循環(huán)(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃ 5 min。結(jié)束后取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物，加入上樣緩沖液電泳檢測，GAPDH為管家基因。SeV：上游引物5′-GGA TCA CTA GGT GAT ATC GAG C-3′，下游引物5′-ACC AGA CAA GAG TTT AAG AGA TAT GTA TC-3′；KOS：上游引物5′-ATG CAC CGC TAC GAC GTG AGC GC-3′，下游引物5′-ACC TTG ACA ATC CTG ATG TGG-3′；Klf4：上游引物5′-TTC CTG CAT GCC AGA GGA GCC C-3′，下游引物5′-AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA-3′；c-Myc：上游引物5′-TAA CTG ACT AGC AGG CTT GTC G-3′，下游引物5′-TCC ACA TAC AGT CCT GGA TGA TGA TG-3′；GAPDH：上游引物5′-GAA GGT GAA GGT CGG AGT-3′，下游引物5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3′。

2 結(jié) 果

2.1人DPSCs、SCAP的原代培養(yǎng)及重編程 體外培養(yǎng)第1天可見單細(xì)胞貼壁生長，第4天形成克隆，1周左右長滿培養(yǎng)瓶。 DPSCs表現(xiàn)為多角形或長梭形，而SCAP多為成纖維細(xì)胞樣或星形，很快形成致密單細(xì)胞層。SeV轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種到基質(zhì)膠3～4 d可觀察到纖維細(xì)胞樣克隆出現(xiàn)，3～4周形成ES樣克隆，質(zhì)地均勻、排列緊密、邊緣清晰，此為iPSCs第0代。挑取成熟iPS克隆繼續(xù)培養(yǎng)，此為iPSCs第1代，以后用EDTA液消化傳代，細(xì)胞維持ES樣克隆特征。隨機(jī)選擇克隆長期培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，邊緣或內(nèi)部未見分化。 RT-PCR結(jié)果表明，兩種iPSCs均不表達(dá)外源性病毒或轉(zhuǎn)錄基因序列，具備臨床應(yīng)用安全性。見圖2。

A：hDPSCs(P0,3 d,×100);B：hDPSCs(P0,8 d,×100);C:hSCAP(P0,3 d,×100);D：hSCAP(P0,8 d,×100);E:hDPSCs-iPS(P10,3 d,×100);F:hSCAP-iPS(P10,8 d,×100);G:H9(P52,3 d,×100);H:人DPSCs、SCAP(P15)RT-PCR結(jié)果

圖2人DPSCs、SCAP原代培養(yǎng)、誘導(dǎo)后iPS細(xì)胞形態(tài)及RT-PCR結(jié)果

2.2人DPSCs、SCAP的重編程效率和時(shí)間 人DPSC、SCAP重編程前細(xì)胞數(shù)量大約為1×104個(gè)，重編程后分別得到68和70個(gè)左右克隆，重編程效率為(0.68±0.02)%、(0.70±0.01)%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。人DPSCs與SCAP重編程時(shí)間分別為(26.0±2.1)、(27.0±1.4)d，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

A：人DPSCs、SCAP重編程效率比較；B：人DPSCs、SCAP重編程時(shí)間比較

圖3人DPSCs、SCAP的重編程時(shí)間及效率比較

3 討 論

重編程技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)干細(xì)胞研究具有重大意義，iPSCs的產(chǎn)生避免破壞胚胎，無免疫排斥反應(yīng)，最終目的是產(chǎn)生患者特異性干細(xì)胞用于再生治療[9]。早期利用病毒性載體在體細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)轉(zhuǎn)錄基因使其重新獲得干細(xì)胞特征，后續(xù)也有研究應(yīng)用非病毒性載體進(jìn)行重編程，但普遍存在效率低下、方法復(fù)雜等缺點(diǎn)[10]。仙臺(tái)病毒為15 kb單鏈RNA病毒，不會(huì)結(jié)合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)效率高，病毒及轉(zhuǎn)錄基因隨著iPSCs的傳代而逐漸消除，是理想的重編程轉(zhuǎn)錄基因的載體[11]。

iPSCs重編程技術(shù)出現(xiàn)以來，多種體細(xì)胞均重編程為iPSCs，包括皮膚成纖維細(xì)胞、外周血細(xì)胞、腎上皮等[12]，獲取方式多為有創(chuàng)性操作。人第3磨牙常因阻生需要拔除，臨床常常丟棄處理。年輕人第3磨牙含有豐富牙髓和根尖組織，易于分離培養(yǎng)DPSCs和SCAP，來源簡便、無創(chuàng)，誘導(dǎo)效率也較傳統(tǒng)方法高[6-7]。有研究表明，越是處于分化早期的幼稚細(xì)胞越容易誘導(dǎo)為iPSCs。誘導(dǎo)時(shí)間與誘導(dǎo)效率可作為客觀指標(biāo)衡量誘導(dǎo)為 iPSCs的能力[13]。本研究利用仙臺(tái)病毒轉(zhuǎn)染人DPSCs和SCAP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞均有較高誘導(dǎo)效率(0.7%左右)，可能與它們能表達(dá)內(nèi)源性重編程基因Klf4、ES細(xì)胞相關(guān)基因Nanog及較高增殖效率等有關(guān)[14]，與MIERE等[15]的研究結(jié)果一致。

體細(xì)胞重編程機(jī)制重點(diǎn)在于核心多潛能性轉(zhuǎn)錄基因網(wǎng)絡(luò)，包括正常細(xì)胞發(fā)育過程中相關(guān)基因的表觀遺傳調(diào)控。重編程基因、miRNA和小分子調(diào)控iPSCs產(chǎn)生的表觀遺傳基因，包括DNA甲基化、組蛋白去甲基化、染色質(zhì)重組等[16]。iPSCs維持多潛能性的基因主要是Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和Nanog。Oct4來自轉(zhuǎn)錄基因POU家族，主要作用為維持細(xì)胞多潛能性，能抑制分化相關(guān)基因的表達(dá)，其位點(diǎn)測序結(jié)果顯示有廣泛去甲基化，Oct4基因?qū)π纬珊途S持iPSCs的多能性和自我更新是和Sox2和Nanog共同完成的[17]。Sox2是性別決定區(qū)-Y框蛋白-2相關(guān)基因，在應(yīng)答白血病抑制因子反應(yīng)時(shí)激活，主要調(diào)控JAK-STAT信號(hào)通路，信號(hào)通路的下調(diào)導(dǎo)致Sox2激活[18]。Nanog在篩選維持ESCs特性的轉(zhuǎn)錄基因時(shí)出現(xiàn)，與Oct4和Sox2一起支持內(nèi)細(xì)胞層，也是多潛能細(xì)胞維持自我更新的必需因素[19]。c-Myc是一種原癌基因，在重編程過程中發(fā)揮催化作用，能增加iPSCs的生成效率。c-Myc與Klf4的相互作用對(duì)重編程至關(guān)重要，c-Myc可增加增殖效率，但過多表達(dá)會(huì)增加p53水平，而Klf4能增加p21水平使增殖效率降低，同時(shí)降低p53水平以減少細(xì)胞凋亡的風(fēng)險(xiǎn)[20]。iPSCs重編程所需時(shí)間通常為16～35 d，編程時(shí)間的長短反映了重編程的難易程度，同時(shí)也體現(xiàn)出重編程過程中變異的風(fēng)險(xiǎn)[21]。

本研究所用仙臺(tái)病毒能編碼Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 4種基因，具備良好的重編程效率，兩種細(xì)胞誘導(dǎo)時(shí)間為27 d左右，與LIEU等[22]的研究結(jié)果相似；得到的iPSCs經(jīng)RT-PCR證實(shí)已無病毒或轉(zhuǎn)錄基因序列的表達(dá)，與CHICHAGOVA等[23]研究結(jié)果一致。與ZOU等[7]利用慢病毒hSTEMCCA-loxP將hSCAP重編程為TF-iPSCs相比，本研究無需后期切除外源性轉(zhuǎn)錄基因，程序簡便，重編程效率較高。同時(shí)筆者采用無飼養(yǎng)層體系(基質(zhì)膠)為培養(yǎng)底物，最大程度減少了外源性因素對(duì)iPSCs的影響。

本研究成功利用仙臺(tái)病毒將人DPSCs和SCAP重編程為iPSCs，取材方便、無創(chuàng)，誘導(dǎo)效率高，得到的iPSCs具備典型干細(xì)胞生物學(xué)特征，為產(chǎn)生符合臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的iPSCs及干細(xì)胞治療提供可靠的細(xì)胞來源和重編程方法。

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