馬雅昌，郭 健，朱雅文，楊朝昕，邱宇辰，金 宇

(1.承德醫(yī)學(xué)院 研究生院，河北 承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 創(chuàng)傷骨科,河北 承德 067000)

骨腫瘤占全身腫瘤的0.2%，其中80%發(fā)生于四肢長骨。至今骨腫瘤的診斷是仍是骨科難題，雖然目前的影像學(xué)技術(shù)能初步鑒別骨腫瘤的良惡性，但卻很難明確診斷。穿刺活組織檢查技術(shù)是目前診斷腫瘤疾病的重要手段，在骨科也有廣泛應(yīng)用，對臨床治療前判斷腫瘤組織的良惡性、組織分型及分化程度都有無可替代的作用，現(xiàn)階段通過穿刺活檢能夠?qū)悄[瘤做出病理學(xué)定性及組織學(xué)分型，對于治療方案的選擇具有重大意義[1]。不恰當穿刺活檢會給腫瘤患者帶來不良后果，正確活檢則需要放射線科、骨科、病理科三方配合操作后做出最后診斷。目前的腫瘤穿刺包括骨腫瘤在內(nèi)的穿刺活檢技術(shù)不能解決穿刺孔出血、瘤組織穿刺后局部轉(zhuǎn)移等不足之處，因為穿刺損傷了腫瘤的包膜及血管，開放了瘤細胞漏出通路，瘤細胞在針道中擴散引起腫瘤細胞釋放，而產(chǎn)生包膜外腫瘤生長的危險[2]。除穿刺活檢器械本身局限外，正確用穿刺器械也同樣重要，如果活檢方法不正確，也會造成腫瘤對血管、神經(jīng)束等組織污染，導(dǎo)致腫瘤切除不凈，而導(dǎo)致治療失敗[3]，因此，我科在總結(jié)大量臨床骨腫瘤穿刺經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，發(fā)明了一種新型的穿刺骨組織的裝置和穿刺后封閉穿刺骨孔的器械，本文擬通過兔VX2骨腫瘤動物模型考察這一新的穿刺技術(shù)裝置能否改善傳統(tǒng)穿刺活檢的不足，降低穿刺引起的腫瘤局部擴散。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗于2016 年5～11月在承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)所完成。實驗動物為清潔級，新西蘭大白兔36只，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，購于天津津南區(qū)春樂實驗動物養(yǎng)殖場，雌雄不限，進行隔籠喂養(yǎng)，實驗前飼養(yǎng)1周。本實驗對動物的處理符合中國《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 主要試劑材料與儀器 RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、VEGF擴增試劑盒(普洛麥格公司)；VEGF引物設(shè)計與合成(上海生工公司)；閉穿刺針、高分子封閉栓(專利號:201310050606.1 見圖1) ；LOGIQ9超聲診斷掃描儀(美國GE公司) ；TG16G高速離心機(天津廣豐公司)；PCR 擴增儀(德國 Eppendorf公司)；紫外分光光度計(德國 Eppendorf 公司)；Lightcycler 熒光定量PCR 儀(Roche公司)；兔VX2 腫瘤組織由廣州吉妮歐生物試劑公司提供。

圖1 新型穿刺技術(shù)裝置的封堵栓及穿刺針

1.3 骨腫瘤穿刺及封堵裝置結(jié)構(gòu) 本文穿刺及封堵骨孔的器械包括套管、密封栓及密封栓的推進器。自主創(chuàng)新的密封栓由高分子聚合物材料制成環(huán)狀翅片、成對凸起或成對倒鉤，凸起或倒鉤的間距及環(huán)狀翅片的直徑均大于套管孔的內(nèi)徑，可自膨脹且在膨脹狀態(tài)下直徑明確大于管體通道的直徑。

通道套管穿入骨組織、拔出通道針芯使骨與體外相通、取出骨組織后再次通過通道套管、封閉栓封堵穿刺孔、拔出套管。圖2 新型穿刺技術(shù)操作過程示意圖

1.4 方法

1.4.1 動物模型建立與穿刺操作 首先制備兔VX2骨腫瘤模型，36只兔于實驗前均禁食12 h，在無菌條件下將試驗用鱗癌瘤組織塊剪切成小于0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm的瘤組織塊，加入PBS液制成瘤混懸液。36只兔用3%的戊巴比妥鈉按1 mL/kg給予耳緣靜脈注射進行麻醉，成功后，將所有實驗兔左脛骨上段去毛消毒，在兔脛骨干骺端用直徑為1 mm克氏針鉆骨至骨髓腔，將鱗癌瘤混懸液注入到骨髓腔內(nèi)，用醫(yī)用骨蠟仔細封口后沖洗縫合。右側(cè)則不予任何處理。VX2瘤組織植入成功后進行標準飼養(yǎng)。于1、2、3、4周后，將實驗兔進行脛骨X線檢查，4周后的36只實驗兔脛骨X線顯示脛骨骨質(zhì)明顯破壞、髓腔密度不等，骨皮質(zhì)未見明顯受累，確定造模成功，此階段實驗兔適宜行腫瘤穿刺操作(見圖3)。對實驗給予3%戊巴比妥鈉(劑量同前)耳緣靜脈注射，麻醉成功后于兔的左側(cè)脛骨結(jié)節(jié)表面剃毛，固定在手術(shù)臺，消毒鋪單。將36只造模成功的兔按隨機數(shù)字表法分為VX2實驗組和VX2對照組，分組后對兩組模型兔的左側(cè)小腿骨腫瘤的區(qū)域進行穿刺操作，VX2實驗組兔采用新型封閉穿刺裝置及技術(shù)穿刺，并在穿刺后用高分子封堵栓對脛骨VX2腫瘤穿刺孔進行封堵，縫合(見圖4)。VX2對照組兔采用傳統(tǒng)穿刺活檢裝置進行穿刺操作，穿刺后穿刺孔不進行封堵，僅采用按壓方式止血。兩組兔穿刺過程中均1次成功并獲取腫瘤組織。術(shù)后預(yù)防性使用抗生素。

4周可見脛骨骨質(zhì)明顯破壞、髓腔密度不等，可見骨皮質(zhì)未見明顯受累，確定造模成功，證明此階段適宜行穿刺活檢操作。圖3 造模兔在瘤細胞液植入后側(cè)位片

1.4.2 B超檢查穿刺孔出血情況 穿刺1 h后，對所有兔穿刺側(cè)脛骨進行B超檢查，觀察封閉栓是否有脫落及出血和血腫形成情況。

1.4.3 總RNA提取 根據(jù)Trizol試劑盒說明書行總RNA提取。用小號骨科刮匙刮取實驗兔穿刺通道及周圍組織，取穿刺通道及周圍組織50～100 mg于含有1 mLTrizol勻漿管中，上均漿儀中勻漿20 s后迅速置于冰上；在超凈臺中溫育5 min后以12 000 r/min離心10 min；吸取上清液至新的1.5 mL離心管中，加200 μL氯仿，搖勻后靜置2 min，12 000 r/min離心10 min；取上清液至新的1.5 mL離心管中，加600 μL異丙醇，混勻后靜置15 min；12 000 r/min離心15 min，棄掉上清液后加1 mL75%無水乙醇洗沉淀，室溫，12 000 r/min離心5 min，棄掉上清液；加1 mL無水乙醇，洗沉淀，室溫，12 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，干燥10 min，室溫；加40 μL DEPC水溶解RNA；置-80 ℃超低溫冰箱。

1.4.4 檢測總RNA的濃度及純度 使用紫外分光光度儀檢測RNA純度和濃度。使用DECP水調(diào)零后加1 μL RNA液行總RNA連續(xù)3次濃度測定，并記錄數(shù)值和均值。判斷RNA純度(A260nm/A280nm)，比值若在1.8～2.0時，說明所測RNA純度達標。計算RNA樣本溶度(計算公式:A260nm×稀釋倍數(shù)×40 μg/mL)。

1.4.5 逆轉(zhuǎn)錄 根據(jù)Promega公司試劑說明書進行。按要求比例配制25 μL體系(RNA-Primer Mix：12 μL、5×RT Reaction Buffer：5 μL、25 mM dNTPs：1 μL、25 U/μL RNase Inhibitor：1 μL、200 U/μL M-MLV Rtase：1 μL、RT引物：1 μL、ddH2O(DNase-free)：3 μL、隨機引物：1 μL的用于定量PCR反應(yīng)的cDNA合成反應(yīng)液。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:37 ℃，60 min；85 ℃，5 min；4 ℃，5 min；置于-20 ℃保存。

1.4.6 qPCR檢測穿刺穿刺通道及周圍組織VEGFmRNA表達量 按要求比例配制25 μL體系(SYBRGreen Mix:12.5 μL、上游引物F：0.5 μL、下游通用引物：0.5 μL、ddH2O：9.5 μL、cDNA模板：2 μL)的定量PCR反應(yīng)液。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min， 95 ℃變性10 s，退火60 ℃15 s，72 ℃延伸50 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。VEGF上游引物：5′-T C A C C T A C T G T C A T C T G C T T C C -3′,下游引物：5′-G G C T A C T A C T T C G T C CA C T C T T-3′。實驗結(jié)果在熒光定量操作系統(tǒng)中進行分析對比，采用2-ΔΔCt對目標基因VEGF的mRNA表達進行定量)。

1.4.7 穿刺通道及周圍組織病理學(xué)檢測 穿刺操作2周后，對腫瘤穿刺通道及腫瘤穿刺孔附近組織進行取樣浸泡于4%甲醛溶液中進行固定石蠟包埋，切片后進行蘇木素伊紅染色。將腫瘤穿刺通道及腫瘤穿刺孔附近組織的病理學(xué)切片診斷結(jié)果進行對比，分析出VX2實驗組與對照組瘤細胞的擴散轉(zhuǎn)移情況。

2 結(jié)果

2.1 穿刺孔周圍血腫情況 穿刺1 h后，B超示VX2實驗組封閉栓均無脫落，其中有2只(11.1%)穿刺孔檢測到出血情況，其余的16只穿刺孔周圍未見出血及血腫；對照組中有15只(83.3%)在穿刺孔周圍檢測到出血情況(見圖4)，兩組出血率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)，證明VX2實驗組穿刺后引起的出血及血腫率明顯降低。

A： VX2對照組穿刺孔周圍檢測到不均勻的回聲區(qū)域，信號雜亂，區(qū)域內(nèi)可見片狀較高回聲；B：VX2實驗組肌肉組織回聲均勻，穿刺孔周邊層次清晰，無血液滲漏情況。圖4 多普勒超聲檢測穿刺孔周圍出血情況

表1超聲技術(shù)檢測兩組穿刺孔出血及血腫形成情況

組別例數(shù)穿刺孔血腫形成有無P對照18153實驗18216<0.01合計361719

2.2 穿刺通道及周圍組織的VEGF mRNA表達 經(jīng)qRT-PCR檢測，兩組標本VEGF mRNA的相對表達量(2-△△t)均呈正態(tài)分布，且方差齊，故采用獨立樣本t檢驗，統(tǒng)計數(shù)據(jù)如下(見表2及圖5)

表2穿刺通道組織VEGF mRNA的相對表達量(2-△△t)統(tǒng)計(n=18)

組別 x±stPVX2對照2.997±1.4543.348<0.01VX2實驗1.670±0.768

**：與對照組比較，P<0.05。圖5 穿刺通道周圍組織VEGF mRNA的相對表達量

2.3 腫瘤擴散轉(zhuǎn)移情況比較 VX2實驗組穿刺通道周圍軟組織中2只(11.1%)發(fā)現(xiàn)瘤細胞，余樣本均示正常，未發(fā)現(xiàn)瘤細胞(見圖6A)。VX2對照組中12只(75.0% ) 發(fā)現(xiàn)瘤細胞(見圖6B) ，兩組腫瘤細胞擴散轉(zhuǎn)移率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) ，VX2實驗組腫瘤細胞擴散率較對照組低。

A:VX2 實驗組病理圖：病理切片可見正常的結(jié)蹄組織，肌纖維切面可見明暗相間的橫紋(箭頭所指)，核多并位于細胞周邊、軟骨基質(zhì)有大量規(guī)則彈性纖維，其病理診斷為正常骨骼肌組織； B:VX2 對照組穿刺后病理圖：病理切片可見骨周圍軟組織破壞顯示不清，有異性腫瘤細胞浸潤、瘤細胞巢狀排列、癌巢見角化珠形成(箭頭所指)，其病理診斷為鱗癌； 蘇木素伊紅染色，A、B × 40)。圖6 VX2實驗組與VX2對照組病理學(xué)圖片

3 討論

3.1 現(xiàn)階段臨床常用穿刺活檢技術(shù) 骨及軟組織腫瘤是嚴重威脅人類健康及生命的一種疾病，近年來骨及軟組織腫瘤發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢和年輕化趨勢，其正確的診斷對該病的治療和預(yù)后有著重大影響。在外科的診斷中，骨骼疾病首選的檢查方法仍然是X線片，多數(shù)情況下，X線片檢查可以較清晰的顯示骨骼結(jié)構(gòu)、病變的大體范圍及骨質(zhì)的破壞情況[4-5]，其對骨骼的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及軟組織顯像不清的情況可進一步選擇 CT、MRI等影像學(xué)檢查[6]，但是在骨腫瘤診斷過程中穿刺活檢操作仍然是骨腫瘤診斷的金標準[7]。穿刺活檢作為腫瘤的常用檢查技術(shù)，具有操作簡便、出血少感染機會小、不影響二次手術(shù)等優(yōu)點?，F(xiàn)階段臨床常用到的骨腫瘤穿刺活檢技術(shù)：①切開活檢：該活檢方法的優(yōu)點是穿刺取得的組織量大，診斷正確率最高，缺點是易引起出血感染和局部瘤組織污染[8]。②套管穿刺：此穿刺方法能夠取出一定量的腫瘤組織，較切開活檢要少，在腫瘤良惡性、腫瘤分期診斷方面應(yīng)用價值很高，是臨床廣為應(yīng)用的穿刺法[9],其同樣不能避免瘤細胞的污染。本研究中使用到的套管針，屬于空芯針類穿刺法的范疇，研究已證實空芯針穿刺法與切開法準確率相近，且空芯針穿刺法引起的并發(fā)癥如出血感染及瘤細胞擴散率均明顯的低于切開活檢法[10]。Kasraeian等研究證明套管針穿刺法準確率高于細針穿刺法[11]。③細針活檢法：該法在診斷腫瘤診斷準確率能達到90%～95%，但因其所得組織量小，在確診腫瘤性質(zhì)分期方面存在缺陷。另外骨皮質(zhì)硬，細針易出現(xiàn)斷針情況，因此在骨腫瘤中應(yīng)用很少。④各種穿刺法與影像學(xué)的結(jié)合：隨著影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展，其在腫瘤穿刺活檢方面也體現(xiàn)出越來越大的價值，各種穿刺技術(shù)在B超等技術(shù)引導(dǎo)下，穿刺技術(shù)逐步更新，明顯提高了穿刺取出腫瘤率，能在穿刺過程中盡可能的避開血管神經(jīng)等重要結(jié)構(gòu)，降低了并發(fā)癥。

3.2 腫瘤穿刺并發(fā)癥及對策 骨腫瘤活檢并發(fā)癥主要包括穿刺通道感染、穿刺孔及通道的出血、瘤細胞污染。雖然臨床醫(yī)師盡了各種努力，但穿刺活檢的并發(fā)癥難以避免。穿刺活檢時，穿刺過程應(yīng)盡可能避免破壞重要神經(jīng)血管及有包膜的結(jié)構(gòu)，另外活檢方式的選擇要考慮到預(yù)期的手術(shù)和治療方案，不合理的活檢方式可能會導(dǎo)致腫瘤細胞的播散及神經(jīng)血管的損傷，有經(jīng)驗的骨腫瘤取材醫(yī)師進行活檢操作可明顯提高穿刺活檢的取出率和準確率。穿刺引起出血是穿刺活檢主要并發(fā)癥之一，多數(shù)出血為少量的，但也需警惕大出血的可能[12]。

本研究中實驗組穿刺過程中隔絕了穿刺通道與周圍正常的組織，使硬質(zhì)骨腫瘤與外界形成了直接通道后再用取樣針通道中提取腫瘤組織，取出腫瘤組織的全過程都不與正常組織接觸，在取樣結(jié)束后用高分子材料封堵栓確切封堵穿刺骨孔。多項研究證明血管內(nèi)皮生長因子可以促進惡性腫瘤增大，促使腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)[13]，在兔VX2腫瘤中VEGF基因亦存在高表達[14]。通過B超檢查發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)穿刺手段可引起穿刺后大多數(shù)的穿刺孔出血，qPCR技術(shù)對穿刺孔周圍及通道組織中VEGFmRNA表達進行定量，亦從分子水平和細胞水平上顯現(xiàn)腫瘤穿刺后瘤細胞轉(zhuǎn)移情況，結(jié)果證明我科自制封閉穿刺裝置進行的活檢有效的控制了腫瘤穿此后的血腫形成及瘤細胞的瘤周組織和穿刺通道的擴散。在本實驗中實驗組樣本行病理學(xué)檢測仍有發(fā)現(xiàn)瘤細胞，筆者認為跟腫瘤內(nèi)部壓力較高有關(guān)，在行穿刺操作與封堵栓行封堵之前瞬間即可有瘤細胞外溢，這種情況的發(fā)生跟具體腫瘤性質(zhì)密切相關(guān)。本課題組在成功建立了兔VX2骨腫瘤動物模型的基礎(chǔ)上采用自創(chuàng)封閉穿刺活檢技術(shù)，并對穿刺孔進行封堵，其克服了傳統(tǒng)穿刺技術(shù)未及時封閉骨孔的缺陷。

現(xiàn)階段的穿刺操作技術(shù)及穿刺器械逐步更新，但穿刺后仍然存在著腫瘤穿刺孔出血及血腫形成的情況、瘤細胞經(jīng)針道擴散而污染周圍組織等并發(fā)癥[15]。此實驗中應(yīng)用了熒光定量PCR技術(shù)和病理學(xué)檢查技術(shù)從分子及細胞水平上證明了該項穿刺技術(shù)及高分子封堵栓可有效降低骨腫瘤穿刺后瘤細胞早期擴散的的發(fā)生，給我們的骨科臨床診斷提供了更安全的方向，值得在臨床推廣和使用。

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