1.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)，廣東 珠海 519041；2.云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明 650091

1 引言

天然藥物化學(xué)是高等醫(yī)藥院校藥學(xué)及相關(guān)專業(yè)必修課程，主要講授天然藥物化學(xué)成分的理化性質(zhì)、提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定，其中結(jié)構(gòu)鑒定是課程的重要內(nèi)容。目前，波譜學(xué)是天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定的主要方法，尤其核磁共振波譜法(NMR)提供的結(jié)構(gòu)信息豐富，譜圖可解析性高，已成為天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定的主要方法。天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型繁多，波譜特征復(fù)雜，而波譜解析抽象難懂，結(jié)構(gòu)鑒定一直是天然藥物化學(xué)的課程難點，是教師不斷探索的教學(xué)改革熱點[1-2]。許多醫(yī)學(xué)院校未設(shè)置專門的波譜解析課程，學(xué)生沒有系統(tǒng)學(xué)習(xí)波譜解析，難以理解與掌握天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定內(nèi)容。為讓學(xué)生更好地學(xué)習(xí)這門課程，作者在課程中加強了結(jié)構(gòu)鑒定的講授，尤其是以科研中遇到的真實化合物的NMR綜合解析為例，通過真實譜圖的清晰展示與講解，讓學(xué)生更直觀具體地理解與掌握相關(guān)知識，提高課程的實踐性[3]。文章介紹以玉龍烏頭(AconitumstapfianumHand.-Mazz.)中分離的新苯甲酰胺衍生物stapfianine B為例講解天然藥物化學(xué)的結(jié)構(gòu)研究章節(jié)[4]。Stapfianine B的結(jié)構(gòu)包含苯環(huán)、酰胺、酯鍵和酚羥基等常見基團，波譜信號明顯且不復(fù)雜，非常適合作為授課內(nèi)容。

2 授課內(nèi)容與方式

2.11H-NMR

1H-NMR靈敏度高易測定，已應(yīng)用于化學(xué)中70余年，積累數(shù)據(jù)豐富，在結(jié)構(gòu)解析中非常重要。首先向?qū)W生簡要介紹1H-NMR圖譜，講解氫譜提供的結(jié)構(gòu)信息(圖1)。氫譜橫坐標(biāo)為峰組位置，用化學(xué)位移(δ)表示標(biāo)注于峰組上方，右邊是高磁場(化學(xué)位移小)，左邊是低磁場(化學(xué)位移大)。縱坐標(biāo)表示吸收峰強度，可積分得到譜線積分面積(氫的數(shù)目)標(biāo)注于峰組下方。1H-NMR譜中還可見峰組耦合裂分，提供耦合常數(shù)(Jin Hz)及裂分信息。

圖1 Stapfianine B的1H-NMR譜

NoδHJ/HzδCNoδHJ/HzδC2134.4s1'115.3s1117.1s2'162.2s67.54d(2.4)117.2d3'7.01d(8.4)118.8d5151.4s4'7.43t(7.6)134.6d47.11dd(8.8,2.4)122.2d5'6.96t(7.6)119.4d38.63d(8.8)122.7d6'7.76d(8.0)126.2d7168.9s7'168.8sOCH3-73.95s52.9qNH-11.94sOH-2'12.34s

2.1.1 峰面積1H-NMR譜中氫的峰面積與相同化學(xué)環(huán)境的氫數(shù)目成正比。一般用甲基信號為標(biāo)準(zhǔn)計算各組峰質(zhì)子數(shù)，如stapfianine B可用甲氧基信號(δH3.95 s, 3H)為計算各峰組質(zhì)子數(shù)[5]。

2.1.2 化學(xué)位移 化學(xué)位移表征官能團出峰位置，其數(shù)值大小取決于氫原子核外電子云密度，電子云密度越大化學(xué)位移值越小，譜峰越位于氫譜右方，反之亦然。任何使化學(xué)位移數(shù)值減小的作用稱為屏蔽效應(yīng)，使化學(xué)位移數(shù)值增大作用稱為去屏蔽效應(yīng)。學(xué)生應(yīng)掌握影響化學(xué)位移的主要因素：誘導(dǎo)效應(yīng)、共軛效應(yīng)、各向異性效應(yīng)、van der Waals效應(yīng)和氫鍵效應(yīng)。

①誘導(dǎo)效應(yīng)指電負性取代基使氫核外電子云密度降低，去屏蔽效應(yīng)增大，化學(xué)位移增大(吸收峰左移)。如甲基(RCH3)約δH0.8，由于誘導(dǎo)效應(yīng)甲氧基低場位移至δH3.2～4.0，stapfianine B中OCH3-7(δH3.95 s)。此外應(yīng)向?qū)W生講解電負性取代帶來其他影響，如常見官能團電負性均大于氫的，故一般而言δCH > δCH2>δCH3[6]。

②共軛效應(yīng)指苯環(huán)氫被含飽和雜原子基團取代(如OCH3、OH)，雜原子未成鍵電子對和苯環(huán)離域電子形成p-π共軛，苯環(huán)電子云密度增大，化學(xué)位移高場位移；被含不飽和雜原子基團取代(如CHO、COR、NH=NR)，形成大的π-π共軛，苯環(huán)電子云密度下降，化學(xué)位移低場位移。

Stapfianine B氫譜可見一個1,2,4-三取代苯環(huán)和一個1,2-二取代苯環(huán)信號，七個氫均位于芳環(huán)化學(xué)位移范圍內(nèi)(δH6.5～8.0)。苯的化學(xué)位移為δH7.27，受取代基影響取代苯環(huán)的氫產(chǎn)生低場或高場位移。Stapfianine B的B環(huán)中羰基-1′與苯環(huán)存在π-π共軛，導(dǎo)致苯環(huán)電子云密度降低，H-6′受影響最大，H-4′處在羰基對位，受到的去屏蔽作用次之，而H-5′和H-3′反而受到了一定屏蔽作用[7]。基于此，化學(xué)位移應(yīng)該是H-6′ > H-4′ > H-5′/H-3′(圖2A)。另一方面，OH-2′氧孤對電子與苯環(huán)形成p-π共軛，導(dǎo)致電子云密度上升，對鄰位氫屏蔽作用最大，對位氫屏蔽其次，間位氫影響最小。因此化學(xué)位移應(yīng)該是H-6′/H-4′ > H-3′ > H-5′(圖2C)。綜合羰基和羥基影響，B環(huán)結(jié)果是H-6′ > H-4′ > H-5′ > H-3′。A環(huán)分析稍復(fù)雜些，因還受到NH影響，其屏蔽作用與OH相比稍弱。如圖1所示從羰基-1影響看，化學(xué)位移是H-6 > H-4 > H-3；從OH-5影響上看，化學(xué)位移為H-3 > H-4 > H-6；NH影響上看，化學(xué)位移是H-4 > H-6 > H-3。綜合羰基、羥基和氨基影響，結(jié)果為H-3 > H-6 > H-4。以上分析與圖譜吻合，這種講解可加深學(xué)生對共軛效應(yīng)的理解和記憶，教學(xué)效果良好。

圖2 取代基對stapfianine B苯環(huán)電子云分布的影響(A：羰基；B：氨基；C：羥基)

③各向異性效應(yīng)指分子中基團電子云非球形對稱時，將對鄰近質(zhì)子附加一個各向異性磁場，使某些質(zhì)子處于該基團屏蔽區(qū)，產(chǎn)生高場位移，某些質(zhì)子處于去屏蔽區(qū)，產(chǎn)生低場位移。這里主要向?qū)W生介紹芳環(huán)、雙鍵、羰基、叁鍵的屏蔽區(qū)和去屏蔽區(qū)位置。

④van der Waals效應(yīng)指兩個質(zhì)子空間上靠近時，具有負電荷的電子云相互排斥，電子云密度減少，化學(xué)位移向低場位移，可舉典型例子講解。

⑤氫鍵效應(yīng)指形成分子內(nèi)氫鍵后，由于靜電場作用電子云密度降低而去屏蔽，化學(xué)位移增大。天然產(chǎn)物中δH10～18羥基峰即為氫鍵效應(yīng)導(dǎo)致。如stapfianine B中OH-2′(δH12.34 s)與酰胺鍵羰基形成氫鍵[8-9]。類似，NH也與甲?；驶纬蓺滏I而產(chǎn)生低場效應(yīng)(δH11.94 s)。

2.1.3 偶合裂分及耦合常數(shù) 耦合裂分是分子中鄰近磁性核之間自旋-自旋耦合作用引起，作用大小以偶合常數(shù)表示。解析氫譜耦合裂分現(xiàn)象對于確定分子中各類氫的相對位置和立體關(guān)系很有幫助。可依據(jù)n+1規(guī)律判斷：當(dāng)某組質(zhì)子有n個相鄰的質(zhì)子時，這組質(zhì)子將裂分為n+1重峰。耦合常數(shù)是氫譜重要數(shù)據(jù)，影響偶合常數(shù)因素主要有偶合核間的距離、角度及電子云密度[10]。Stapfianine B中氧甲基、酚羥基及酰胺氨基鄰位沒有氫取代，故為單峰(s)。A環(huán)中H-3與H-4發(fā)生J3偶合，故峰形為標(biāo)準(zhǔn)二重峰(d)，苯環(huán)J3偶合常數(shù)一般約8.0 Hz(實際8.8 Hz)。H-6與H-4發(fā)生J4偶合，峰形也為d峰，J4偶合常數(shù)比較小，一般0～3 Hz(實際2.4 Hz)。H-4則除了與H-3發(fā)生J3偶合，還與H-6發(fā)生J4偶合，故峰形為雙二重峰(dd)，偶合常數(shù)為8.8 Hz和2.4 Hz。B環(huán)是不同基團的鄰位取代苯環(huán)，譜圖非常復(fù)雜。但因核磁儀器頻率不高，苯環(huán)氫化學(xué)位移差異小，可作一級譜近似分析。H-3′和H-6′鄰位只有1個氫，故裂分為d峰，H-4′和H-5′鄰位2個氫，故裂分為三重峰(t)。

2.213C-NMR和DEPT13C-NMR靈敏度低于氫譜但分辨率更高(常用δH0～15，δC0～300)，且碳原子是構(gòu)成有機物骨架的元素，13C-NMR可提供分子骨架信息，故在有機物結(jié)構(gòu)鑒定中作用極大。這里主要向?qū)W生介紹常用13C-NMR測定技術(shù)質(zhì)子寬帶去耦法和DEPT法進行結(jié)構(gòu)解析(圖3)。與氫譜類似碳譜橫坐標(biāo)是化學(xué)位移(δ)，縱坐標(biāo)為吸收峰強度。采用去耦技術(shù)的碳譜只有譜線而不進行積分。13C-NMR譜中每一個碳都出現(xiàn)一個信號，而DEPT 135°譜季碳消失，亞甲基向下，次甲基和甲基向上，DEPT 90°譜只有向上的次甲基。據(jù)此可判斷每個碳的級數(shù)，區(qū)分結(jié)構(gòu)中的季碳、次甲基、亞甲基和甲基。

Stapfianine B中15個碳均在13C NMR譜出現(xiàn)信號。13C-NMR譜中酯基和酰胺基的羰基化學(xué)位移在最低場，分別在δC168.9 s和δC168.8 s。氧甲基(δC52.9 q)碳受到誘導(dǎo)效應(yīng)而產(chǎn)生明顯低場位移，一般RCH3約δC15～30，OCH3則δC45～60。苯的碳化學(xué)位移為δC128，與氫類似受取代基影響化學(xué)位移在δC120～160波動。同樣對于選定的碳原子，其變化量是幾個取代基效應(yīng)之和。B環(huán)中C-2′因為電負性取代基的誘導(dǎo)效應(yīng)影響(OH-2)，出現(xiàn)在δC162.2。羥基取代使苯環(huán)其它碳原子高場位移，影響大小鄰位(C-1′/C-3′)>對位(C-5′)>間位(C-6′/C-4′)，故化學(xué)位移為C-2 > C-4/C-6 > C-5 > C-1/C-3。羰基取代對苯環(huán)取代碳和其它碳影響都較小，僅使苯環(huán)碳略往低場移動。結(jié)合羥基和羰基影響，B環(huán)化學(xué)位移為C-2 > C-4 > C-6 > C-5 > C-3 > C-1。A環(huán)和B環(huán)類似，但增加了氨基影響，其效應(yīng)與-OH一致。

圖3 Stapfianine B的13C-NMR譜

2.3 二維核磁共振譜 2D NMR是有機物結(jié)構(gòu)鑒定的有力工具，尤其是對未知物的結(jié)構(gòu)的推導(dǎo)，比1D NMR能夠提供更多的信息，更為客觀、可靠。常用的2D NMR技術(shù)主要有1H-1H COSY、HMQC、HMBC和ROESY等，結(jié)合stapfianine B的圖譜向?qū)W生依次進行介紹。

2.3.11H-1H COSY譜1H-1H COSY是最常用的2D NMR譜，反映的同一個耦合體系中質(zhì)子的相關(guān)(3J)，即相鄰兩個碳上的氫或同一個碳化學(xué)不等價的兩個氫的相關(guān)。在譜圖中可以看到stapfianine B的A環(huán)H-3/H-4的相關(guān)，B環(huán)H-3/H-4，H-4/H-5，H-5/H-6的相關(guān)(圖4)。這些相關(guān)驗證了1D NMR對Stapfianine B結(jié)構(gòu)的推斷。

2.3.2 HSQC譜 HSQC譜反映的是1H和與其直接相連13C的相關(guān)。通過HSQC可建立碳譜和氫譜的關(guān)聯(lián)，實現(xiàn)氫原子往碳原子上的歸屬，對于推導(dǎo)未知物的結(jié)構(gòu)或已知結(jié)構(gòu)化合物的碳譜和氫譜的指認十分重要。在譜圖中可以看到A環(huán)H-3/C-3，H-4/C-4、H-6/C-6的相關(guān)(圖5)；B環(huán)H-3/C-3，H-4/C-4，H-5/C-5，H-6/C-6的相關(guān)，通過這些相關(guān)可對stapfianine B的碳氫譜數(shù)據(jù)進行歸屬。氫譜中剩余無相關(guān)的峰組，則認為是活潑氫(OH，NH)。

圖4 Stapfianine B的1H-1H COSY譜(表示1H-1H COSY相關(guān))

圖5 Stapfianine B的HSQC譜

2.3.3 HMBC譜 HMBC譜反映的是1H和遠程耦合的13C的相關(guān)，即關(guān)聯(lián)跨越2～4根化學(xué)鍵的1H和13C。HMBC譜比較復(fù)雜，解析困難，但對于推斷結(jié)構(gòu)極為重要。因為1H-1H COSY譜和HMQC譜在未知物的結(jié)構(gòu)推斷中，往往終止于季碳和雜原子，只能得到結(jié)構(gòu)片段，這些片段的連接只能依靠HMBC譜來完成。Stapfianine B的關(guān)鍵HMBC相關(guān)如圖6所示，H-3/C-2，屬于相隔2根化學(xué)鍵的相關(guān)，H-3/C-1，H-3/C-5是相隔3根化學(xué)鍵的相關(guān)，在HMBC譜中作用最大。H-6′與酰胺鍵羰基的相關(guān)正是Stapfianine B中兩個片段通過酰胺鍵連接的關(guān)鍵證據(jù)。H-6與甲酰基羰基相關(guān)是甲?；?1取代位置的關(guān)鍵證據(jù)。從這個圖譜可以讓學(xué)生清楚了解HMBC譜圖在結(jié)構(gòu)解析中的強大功能。

圖6 Stapfianine B的HMBC譜(表示HMBC相關(guān))

2.3.4 ROESY譜 ROESY譜反映的是兩個氫的空間距離，主要用于解決立體化學(xué)的問題。譜中H-3/H-4，H-3′/H-4′，H-4′/H-5′，H-5′/H-6′的相關(guān)屬于鄰位氫相關(guān)，在結(jié)構(gòu)鑒定中意義不大(圖7)。H-6′/氨基的相關(guān)對于驗證和確定B苯環(huán)的取代基位置有一定參考意義。

圖7 Stapfianine B的ROESY譜(表示ROESY相關(guān))

3 教學(xué)效果

天然藥物化學(xué)的結(jié)構(gòu)解析內(nèi)容抽象難懂，學(xué)生難以理解和掌握。教材著重于基礎(chǔ)理論而應(yīng)用性不強，學(xué)生往往掌握了課本知識遇到具體天然產(chǎn)物的NMR解析仍無從下手。通過科研中的原始天然產(chǎn)物真實譜圖的清晰展示和詳細講解，系統(tǒng)地向?qū)W生介紹核磁共振主要譜圖的功能。學(xué)生可以直觀、具體地接觸到核磁譜圖，從而更好地理解與掌握NMR的相關(guān)知識及其應(yīng)用。講解過程，學(xué)生可充分參與進來，通過辨識譜峰(包括溶劑峰、雜質(zhì)峰)，獲得化學(xué)位移和積分?jǐn)?shù)據(jù)，計算偶合常數(shù)，尋找二維相關(guān)等，使知識不再停留在理論，學(xué)生可獲得綜合運用波譜進行化合物結(jié)構(gòu)解析的能力，掌握天然化合物結(jié)構(gòu)解析的方法和步驟。這種教學(xué)方式有助于學(xué)生接受與理解教學(xué)內(nèi)容，讓學(xué)生深刻理解該課程的意義，并通過對課程的學(xué)習(xí)養(yǎng)成良好的科研素養(yǎng)，也提高了課程的實踐性，提高學(xué)生學(xué)習(xí)新知識的主動性和積極性，為培養(yǎng)創(chuàng)新型、實踐型高素質(zhì)人才打下堅實基礎(chǔ)。

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