林立騰， 蔡明岳， 黃文藪， 黃敬君， 蘭 天， 朱康順

門靜脈高壓癥（PHT）是肝硬化最嚴(yán)重的并發(fā)癥［1］，也是介入治療領(lǐng)域重要攻堅(jiān)難題［2］。 其發(fā)病機(jī)制主要包括肝內(nèi)血管阻力增加和內(nèi)臟高動(dòng)力血循環(huán)［3］。理想的動(dòng)物模型對(duì)深入闡明PHT發(fā)病機(jī)制及臨床前藥效評(píng)估具有重要意義。小鼠模型近年逐漸應(yīng)用于PHT研究，膽總管結(jié)扎（BDL）及四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)是目前構(gòu)建肝硬化性PHT模型最常用方法［4］，但評(píng)價(jià)這兩種小鼠模型的研究報(bào)道甚少。本研究采用BDL及CCl4誘導(dǎo)兩種方法構(gòu)建PHT小鼠模型，并通過經(jīng)門靜脈主干穿刺提高定量測(cè)取門靜脈壓成功率，結(jié)合血清學(xué)指標(biāo)、肝臟病理學(xué)表現(xiàn)比較兩種模型的可靠性，為PHT模型選擇與應(yīng)用提供參考與思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和器材

取24只8周齡雄性C57BL/6小鼠（中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），隨機(jī)分成4組（假手術(shù)對(duì)照組、BDL組、玉米油對(duì)照組、CCl4誘導(dǎo)組），每組6只。

實(shí)驗(yàn)器材包括生物信號(hào)采集與分析系統(tǒng)（成都泰盟科技公司）、直剪、止血鉗、玻璃分針、24 G留置針、戊巴比妥鈉、CCl4（上海阿拉丁試劑公司）、玉米油、青霉素-鏈霉素混合雙抗（美國(guó)Gibco公司）、谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）/天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程所）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（SMA）抗體（武漢博士德生物工程公司）、羊抗小鼠二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）。

1.2 PHT小鼠模型構(gòu)建

BDL法——戊巴比妥鈉50 mg/kg經(jīng)實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔注射致麻醉良好后，取仰臥位，固定四肢，腹部剃毛、消毒，沿腹中線行約1 cm切口，鈍頭玻璃分針小心游離并暴露膽總管，行上下端雙側(cè)結(jié)扎，逐層縫合關(guān)腹，手術(shù)切口消毒［5］；對(duì)假手術(shù)對(duì)照組小鼠單純游離膽總管而不結(jié)扎。術(shù)后4周檢測(cè)門靜脈壓，下腔靜脈取血、分離肝臟組織分別用于血清生化指標(biāo)檢測(cè)及肝臟病理學(xué)檢查。

CCl4誘導(dǎo)法——局部皮膚消毒后經(jīng)皮下注射CCl4玉米油溶液（1 mL/kg 體重，每周 2 次）［6］；對(duì)照組僅注射玉米油。12周后檢測(cè)門靜脈壓，取材用于后續(xù)檢測(cè)。

1.3 小鼠門靜脈壓檢測(cè)

采用經(jīng)門靜脈主干直接穿刺法檢測(cè)門靜脈壓。如上述麻醉良好后，小鼠取仰臥位，四肢固定后腹部脫毛、消毒，沿腹中線行約3 cm切口，充分暴露肝門部并用鈍頭玻璃分針小心游離門靜脈主干，用24 G留置針穿刺門靜脈主干，見門靜脈血反流后將留置針另一端接口經(jīng)血壓傳感器連于生物信號(hào)采集與分析系統(tǒng)。待血流穩(wěn)定后記錄門靜脈壓值。

1.4 血清生化指標(biāo)及肝臟病理學(xué)檢查

門靜脈壓測(cè)取后，經(jīng)下腔靜脈穿刺取血，室溫中以5 000轉(zhuǎn)/min離心30 min得到血清，根據(jù)試劑盒說明書方法檢測(cè)ALT、AST值。分離肝臟組織，用4%甲醛溶液固定24 h，脫水、石蠟包埋后切片，蘇木精-伊紅（HE）及天狼星紅染色后鏡下觀察。

1.5 α-SMA免疫組化檢查

肝臟石蠟切片經(jīng)脫蠟處理后，用檸檬酸緩沖液高溫高壓中修復(fù)20 min，3%過氧化氫溶液處理10 min，磷酸緩沖液（PBS）洗3遍后用5%蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（BSA）室溫封閉 1 h，α-SMA一抗 4℃孵育過夜；次日于室溫中復(fù)溫30 min后PBS洗3遍，用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠二抗室溫孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色后 HE 染色 30 s，鹽酸乙醇溶液分化后脫水封片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)各組小鼠門靜脈壓、ALT及AST作t檢驗(yàn)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用Image J軟件對(duì)各組小鼠天狼星紅及α-SMA染色陽性區(qū)域進(jìn)行量化分析，SPSS 17.0軟件作單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 PHT形成

4組小鼠均成功地經(jīng)門靜脈主干穿刺并測(cè)取門靜脈壓值，BDL組明顯高于假手術(shù)對(duì)照組，分別為（3.97±0.41） mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）、（7.63±1.45）mmHg；CCl4誘導(dǎo)組也明顯高于玉米油對(duì)照組，分別為（3.86±0.78） mmHg、（9.82±1.24） mmHg；兩種方法均能成功構(gòu)建PHT小鼠模型，其中CCl4誘導(dǎo)的小鼠門靜脈壓上升更為顯著（圖 1）。

圖1 BDL及CCl4誘導(dǎo)PHT小鼠模型門靜脈壓值

2.2 肝功能改變

血清ALT、AST檢測(cè)顯示，兩模型組小鼠ALT、AST水平相比相應(yīng)對(duì)照組均有不同程度上升，BDL組相比CCl4誘導(dǎo)組上升更為顯著，分別達(dá)到（362.53±74.18） U/L、（650.38±174.87） U/L，提示 BDL 對(duì)小鼠肝功能損傷更為嚴(yán)重（圖2）。

圖 2 BDL及CCl4誘導(dǎo)PHT小鼠模型血清ALT、AST值

2.3 肝纖維化形成

肝臟石蠟切片HE染色結(jié)果顯示，兩種造模方法構(gòu)建的PHT小鼠模型肝臟均出現(xiàn)正常結(jié)構(gòu)紊亂、小葉結(jié)構(gòu)破壞、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞空泡樣變、門靜脈匯管區(qū)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理表現(xiàn)，BDL組還可觀察到明顯的膽管擴(kuò)張（圖3）；天狼星紅染色顯示，兩模型肝臟均有大量膠原沉積，CCl4誘導(dǎo)組肝臟小葉間膠原纖維增生與周圍增生的纖維間隔連接、包繞形成典型的假小葉結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)重度肝纖維化病理學(xué)表現(xiàn)，BDL組肝臟膠原沉積則主要分布于擴(kuò)張的膽管及門靜脈區(qū)周圍（圖4），CCl4誘導(dǎo)組染色陽性區(qū)百分比均值雖高于BDL組，但兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5）；兩種造模方法均使小鼠模型出現(xiàn)嚴(yán)重肝纖維化改變。

圖3 PHT小鼠模型肝臟石蠟切片HE染色結(jié)果

圖4 PHT小鼠模型肝臟石蠟切片天狼星紅染色結(jié)果

圖5 肝臟天狼星紅染色陽性區(qū)域

2.4 α-SMA免疫組化檢查

肝星狀細(xì)胞激活是肝纖維化最主要發(fā)病機(jī)制［7］，α-SMA高表達(dá)是肝星狀細(xì)胞激活標(biāo)志。免疫組化染色檢測(cè)結(jié)果顯示，兩種方法構(gòu)建的PHT小鼠模型肝臟α-SMA表達(dá)明顯高于各自對(duì)照組，且其陽性表達(dá)分布基本與上述肝纖維化區(qū)域一致（圖 6），由此可知兩種小鼠模型PHT發(fā)生可能與肝星狀細(xì)胞激活有關(guān)；CCl4誘導(dǎo)組α-SMA免疫組化染色陽性區(qū)百分比均值雖高于BDL組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 7）。

圖6 PHT小鼠模型肝臟石蠟切片α-SMA免疫組化染色結(jié)果

圖7 肝臟α-SMA免疫組化染色陽性區(qū)域

3 討論

PHT作為肝硬化最嚴(yán)重的并發(fā)癥，可引起上消化道大出血、脾功能亢進(jìn)及頑固性腹水，是肝硬化患者第一大死因［8-9］。臨床上肝臟移植可從根源上治療PHT，然而肝源短缺及醫(yī)療費(fèi)用昂貴使其廣泛應(yīng)用受限［10］。 經(jīng)頸靜脈肝內(nèi)門體分流術(shù)（TIPS）可在短期內(nèi)有效地降低門靜脈壓，控制食管胃底靜脈曲張破裂出血，其主要療效指標(biāo)均優(yōu)于內(nèi)科治療［11］，但術(shù)后易引起肝性腦病，且存在一定的分流道狹窄/閉塞率，影響中遠(yuǎn)期療效［12］。總體上，PHT臨床治療效果亟待提高，深入開展PHT基礎(chǔ)研究并帶動(dòng)臨床治療手段發(fā)展顯得十分重要。PHT基礎(chǔ)研究中，小鼠模型相對(duì)大鼠模型應(yīng)用較少，而小鼠在基因修飾、近交系培育等方面獨(dú)具優(yōu)勢(shì)，更有利于疾病機(jī)制研究［13］。BDL及CCl4誘導(dǎo)肝硬化性PHT小鼠模型近年逐漸應(yīng)用于PHT研究［3］，系統(tǒng)評(píng)價(jià)這兩種小鼠模型對(duì)于深入闡明PHT發(fā)病機(jī)制及臨床前藥效評(píng)估具有重要意義。

本研究采用BDL及CCl4誘導(dǎo)兩種方法構(gòu)建肝硬化PHT小鼠模型［14］，旨在探究?jī)煞N模型PHT與肝功能、肝臟病理學(xué)改變及肝纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)的關(guān)系，通過延長(zhǎng)上述兩種方法造模時(shí)間成功地使小鼠門靜脈壓上升；結(jié)果顯示CCl4誘導(dǎo)比BDL更為顯著地升高了門靜脈壓，BDL小鼠比CCl4誘導(dǎo)小鼠ALT、AST上升卻更為顯著。ALT、AST上升反映肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞破壞和肝功能損傷，提示肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞破壞可能并非小鼠門靜脈壓力上升的主要原因。本研究CCl4誘導(dǎo)組小鼠存活率為百分之百，BDL組小鼠生存率相對(duì)較低（70%），可能與BDL組肝功能損害更為嚴(yán)重相關(guān)。本研究采用HE染色及天狼星紅染色對(duì)小鼠肝臟進(jìn)行病理學(xué)評(píng)估，結(jié)果顯示兩種小鼠模型肝臟均出現(xiàn)正常結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞、膠原顯著沉積的典型肝硬化病理學(xué)表現(xiàn)。BDL和CCl4誘導(dǎo)肝纖維化機(jī)制雖然不同［15］，但兩種方法所致PHT的共同病理基礎(chǔ)均為肝硬化形成，這與人肝硬化PHT形成的病理過程較為接近。肝星狀細(xì)胞激活在肝纖維化及肝硬化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著最主要作用［16］，α-SMA表達(dá)是肝星狀細(xì)胞激活的標(biāo)志。本研究中兩種方法構(gòu)建小鼠模型肝臟切片免疫組化染色結(jié)果均顯示α-SMA顯著高表達(dá)，提示PHT形成與肝星狀細(xì)胞激活有關(guān)，PHT治療中抑制肝臟α-SMA表達(dá)可能是一較好切入點(diǎn)。以上結(jié)果表明，BDL及CCl4誘導(dǎo)方法構(gòu)建的PHT小鼠模型門靜脈壓升高與肝功能損傷、肝臟結(jié)構(gòu)破壞和膠原沉積、肝纖維化相關(guān)蛋白高表達(dá)具有相關(guān)性。

關(guān)于門靜脈壓檢測(cè)，對(duì)大鼠PHT模型較多采用經(jīng)回結(jié)腸靜脈穿刺測(cè)取門靜脈壓［17］。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)中由于小鼠回結(jié)腸靜脈較細(xì)小，穿刺操作難度較大，成功率不高；選用相對(duì)較粗大的門靜脈主干穿刺后，提高了成功率，從而能順利通過血壓傳感器將穿刺留置針接口連接于生物信號(hào)采集與分析系統(tǒng)，進(jìn)行準(zhǔn)確的量化檢測(cè)。經(jīng)PHT小鼠模型門靜脈主干穿刺測(cè)取門靜脈壓是一種相對(duì)簡(jiǎn)單、高效的方法。

總之，BDL及CCl4誘導(dǎo)方法均能成功構(gòu)建PHT小鼠模型，其門靜脈壓、血清學(xué)生化指標(biāo)及肝臟病理學(xué)等方面均符合PHT特點(diǎn)。PHT小鼠模型構(gòu)建在PHT基礎(chǔ)研究中將有廣闊的應(yīng)用前景。

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