胡紹杰,蔣莎莎,張 瑾,于 博,羅 丹,楊良燕,衷畫畫,洪芬芳,楊樹龍*

（1.南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室,中國(guó)江西南昌330006;2.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,中國(guó)江西南昌330031）

衰老是一種以機(jī)體功能減退和外觀衰老為特征的自然過程。肝臟衰老主要表現(xiàn)為代謝功能減退,以及外觀褐色萎縮（brown atrophy）。細(xì)胞凋亡（apoptosis）系一種程序性細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡的途徑包括內(nèi)源性和外源性兩種途徑,可清理異常的細(xì)胞,維持組織器官的穩(wěn)定。細(xì)胞凋亡在肝臟衰老中存在有利和不利的雙重作用,且與老年性肝病發(fā)生有關(guān)。本文就近年來細(xì)胞凋亡在肝臟衰老過程中的作用予以綜述。

1 肝臟衰老

衰老作為一個(gè)普遍的自然規(guī)律,表現(xiàn)為衰老器官或組織形態(tài)和功能的改變。輕度的衰老損傷生理功能,而重度的衰老可以導(dǎo)致功能失代償甚至最終的死亡。肝臟衰老也是如此。肝臟衰老通常伴隨著肝臟形態(tài)的變化和代謝等功能的減退。

肝臟老化是指肝臟逐漸退化的漫長(zhǎng)過程。肝臟衰老可被認(rèn)為是肝臟老化的結(jié)局,是肝臟退化后的狀態(tài)。在形態(tài)學(xué)上,衰老肝臟表現(xiàn)為褐色萎縮、體積和容積變小以及質(zhì)量減輕。肝臟的褐色萎縮是在肝臟老化過程中,由于過多的脂褐質(zhì)（lipofuscin）堆積而形成的[1]。老化過程中,肝臟內(nèi)的血流量明顯減少約35%,從而引起肝臟相應(yīng)的體積和容積變小[2]。此外,在解剖研究中發(fā)現(xiàn),相比年輕的正常肝臟,衰老肝臟的質(zhì)量在男性中減輕約24%,在女性中減輕約18%[3]。

肝臟衰老與肝臟功能的減退密切相關(guān)。肝臟衰老不僅減少白蛋白、球蛋白等物質(zhì)在肝臟的合成,還使細(xì)胞ATP生成減少。同時(shí),衰老的肝臟清理異常細(xì)胞的能力也會(huì)發(fā)生退化,這使得異常細(xì)胞可能向惡性細(xì)胞進(jìn)展并最終成為癌細(xì)胞。在肝臟老化中,肝臟細(xì)胞內(nèi)線粒體的老化l成氧化物生成增多,這導(dǎo)致了氧化與抗氧化之間的失衡,容易引發(fā)DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化損傷[4]。此外,老化過程中端粒逐漸縮短,肝臟細(xì)胞的有絲分裂減少,從而降低肝臟細(xì)胞增殖能力。

2 細(xì)胞凋亡途徑

細(xì)胞凋亡機(jī)制主要由兩種途徑組成:外源性凋亡途徑和內(nèi)源性凋亡途徑。外源性途徑主要由死亡受體（death receptor,DR）主導(dǎo),包括Fas受體（Fas recepter）、TNF-1 受體（tumor necrosis factor receptor 1,TNF-receptor 1）和 TRAIL 受體（TNF-related apoptosis inducing ligand receptor,TRAIL-R）等。當(dāng)相應(yīng)的配體與這些受體結(jié)合時(shí),DR發(fā)生構(gòu)象改變,進(jìn)而聚集細(xì)胞質(zhì)適配蛋白,比如Fas相關(guān)域蛋白（Fas-associated protein with death domain,FADD）,隨后聚集凋亡信號(hào)通路分子,比如caspase-8,最終形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體（death-inducing signaling complex,DISC）,激活產(chǎn)生效應(yīng)的caspase-3、6 和 7[5]。

內(nèi)源性凋亡途徑主要由細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器觸發(fā)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress,ER stress）、細(xì)胞核內(nèi)DNA損傷、溶酶體通透性改變和線粒體功能障礙都可誘導(dǎo)內(nèi)源性凋亡,其中以線粒體功能障礙為主要途徑。線粒體功能障礙引發(fā)多種促凋亡蛋白（比如細(xì)胞色素c）向細(xì)胞質(zhì)中釋放后,促凋亡蛋白和凋亡蛋白激活因子1（apoptosis protease-activating factor-1,Apaf1）以及 caspade-9共同形成活化復(fù)合體,即凋亡小體（apoptotic body）。凋亡小體激活caspase-3、6和7,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6]。由線粒體功能障礙調(diào)節(jié)的凋亡還受Bcl-2家族蛋白（B cell lymphoma 2 family protein）的調(diào)節(jié),其中Bcl-2和Bcl-xL（B cell lymphoma-extra large）屬于抗凋亡蛋白,Bax（Bcl-2 assaciated X protein）屬于促凋亡蛋白[7,8]。此外,內(nèi)源性途徑還與“氧化應(yīng)激”理論的活性氧類（reactive oxygen species,ROS）密切相關(guān)。大量的氧化應(yīng)激產(chǎn)生高濃度的ROS,而ROS打破氧化與抗氧化的平衡,并損傷遺傳物質(zhì),損害細(xì)胞,誘導(dǎo)凋亡[9]。

3 細(xì)胞凋亡與肝臟衰老

細(xì)胞在其所處的微環(huán)境中容易受到多種應(yīng)激刺激,比如氧化、水解、烷化、電離輻射等。遭遇這些應(yīng)激源時(shí),細(xì)胞通過調(diào)控基因表達(dá)和細(xì)胞器作用產(chǎn)生一系列的應(yīng)激反應(yīng),減輕或消除應(yīng)激源對(duì)細(xì)胞的損傷。例如,ROS的合成與清除不平衡時(shí)可使細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激,此時(shí),p53基因被細(xì)胞內(nèi)ROS激活。P53具有減輕和增強(qiáng)氧化應(yīng)激的雙重作用:一方面,P53 可增強(qiáng)PIG3、PIG6、FDXR等基因的表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物將增加細(xì)胞內(nèi)ROS并使細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激更加敏感;而另一方面,P53可激活多種抗氧化基因（PIG12、ALDH4A1、GPX1、SOD2等）以減輕氧化應(yīng)激程度[10]。P53的作用取決于細(xì)胞的應(yīng)激程度:當(dāng)細(xì)胞面對(duì)生理的應(yīng)激時(shí),P53抵抗氧化應(yīng)激;當(dāng)細(xì)胞面對(duì)致命性的應(yīng)激時(shí),P53增加ROS并激活Bax蛋白引發(fā)凋亡[11]。雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）是一種與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的蛋白質(zhì),其活化可使細(xì)胞周期阻滯而導(dǎo)致細(xì)胞衰老。ROS可激活mTOR,而P53可抑制mTOR。由此,P53在抗氧化的同時(shí)還可抗衰老。P53的激活對(duì)mTOR的抑制不僅有抗衰老作用,還可以誘發(fā)細(xì)胞自噬[12]。自噬是一種分解代謝的途徑。在該途徑中,細(xì)胞質(zhì)中受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器等可以被傳遞至溶酶體,并發(fā)生融合形成自噬體,最終降解腔內(nèi)的內(nèi)容物[13]。ROS的增多可引起線粒體DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）的突變,導(dǎo)致線粒體內(nèi)ATP合成減少和呼吸鏈功能異常[14,15]。細(xì)胞自噬r可及時(shí)清除受損傷的線粒體,保持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定狀態(tài)。而P53可通過AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）影響損傷調(diào)控的自噬調(diào)節(jié)（damage-regulated autophagy modulator,DRAM）,進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞自噬[16]。被ROS激活的p53能夠激活其下游的p21基因,P21結(jié)合多種細(xì)胞周期蛋白（cyclin）和Cdk復(fù)合物比如cyclin D1-Cdk4、cyclin E-Cdk2和cyclin A-Cdk2等,阻礙細(xì)胞周期進(jìn)展,導(dǎo)致細(xì)胞在G1期發(fā)生周期阻滯,限制細(xì)胞DNA復(fù)制[17]。P21也能與增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）結(jié)合,使PCNA失去在DNA復(fù)制中作為DNA聚合酶的作用,導(dǎo)致G1期阻滯[18]。細(xì)胞周期發(fā)生阻滯時(shí),促生長(zhǎng)通路比如Erk/MAPK和Akt通路仍產(chǎn)生生長(zhǎng)刺激,而細(xì)胞生長(zhǎng)的大小是有限的,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)不能由細(xì)胞分裂補(bǔ)充時(shí),將導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生衰老[19]。ROS不僅影響mtDNA,還損害核DNA。例如ROS可將鳥嘌呤氧化損傷為8-氧-7-氫脫氧鳥嘌呤（8-oxodGTP）,這一過程可被堿基切除修復(fù)機(jī)制修復(fù)。細(xì)胞內(nèi)還存在核苷酸切除修復(fù)和雙鏈斷裂修復(fù)等機(jī)制[20]。當(dāng)受損的DNA不能完全被修復(fù)而發(fā)生積累時(shí),細(xì)胞可能發(fā)生上述P53/P21導(dǎo)致的衰老、內(nèi)源性途徑的凋亡甚至癌變。綜上所述,細(xì)胞遭遇ROS時(shí)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列復(fù)雜的反應(yīng),而細(xì)胞最終的結(jié)果可能是:應(yīng)激消除、凋亡、衰老、癌變。

肝臟衰老時(shí),肝臟細(xì)胞可通過增加凋亡而避免癌變。肝臟在老化過程中受到多種應(yīng)激刺激,而衰老肝臟細(xì)胞內(nèi)DNA容易受損,且衰老的肝臟細(xì)胞DNA修復(fù)能力下降。甲磺酸甲酯（methyl methanesulfonate,MMS）可直接烷基化細(xì)胞中的DNA,導(dǎo)致DNA損傷。Suh等[21]向衰老雄性大鼠注射MMS,l成大鼠大腦和肝臟相同的核DNA損傷后,發(fā)現(xiàn)腦癌的發(fā)生率遠(yuǎn)大于肝癌的發(fā)生率,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這是由于MMS激活P38與JNK通路誘發(fā)肝臟細(xì)胞大量凋亡。在這一過程中,MMS可以磷酸化SEK1（SAPK or extracellular signal-regulated protein kinase kinase 1）/MKK4（MAPK kinase 4）中的Thr223,被磷酸化的Thr223可激活P38與JNK通路,而后二者通過下游的ATF-2（activating transcription factor-2）和c-Jun等信號(hào)誘導(dǎo)凋亡。

凋亡在及時(shí)清除已經(jīng)轉(zhuǎn)變的異常細(xì)胞以避免癌變的同時(shí),也可導(dǎo)致衰老的發(fā)生。Park等[22]使年輕小鼠中的Xpd基因發(fā)生突變,導(dǎo)致小鼠的核苷酸切除修復(fù)機(jī)制發(fā)生缺陷?；诖?對(duì)小鼠的肝臟進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),肝臟中不僅Fas受體的基因上調(diào),而且Xpd基因的缺陷還可激活P53,被激活的P53可以調(diào)控Bcl-2家族蛋白中的促凋亡蛋白如Bax、Bak和Bok,最終使肝臟細(xì)胞凋亡顯著增加[23]。雖然肝臟通過上調(diào)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子-3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）增強(qiáng)肝臟細(xì)胞再生,但是仍難以補(bǔ)充凋亡的肝臟細(xì)胞,這導(dǎo)致肝臟細(xì)胞新生和消耗的失衡。由于過度凋亡,肝臟合成脂質(zhì)、解毒和清除異常物質(zhì)的功能下降,引發(fā)過早衰老,出現(xiàn)比如肝臟質(zhì)量減輕、肝臟發(fā)生脂褐質(zhì)沉積等現(xiàn)象。

4 細(xì)胞凋亡在肝臟衰老中的保護(hù)作用

在正常的生理狀態(tài)下,肝臟的凋亡水平隨著老化的進(jìn)展而升高。在許多情況下,凋亡可保護(hù)衰老的肝臟,并維持肝臟的正常功能。當(dāng)肝臟遭遇來自飲食中的基因毒素和自由基的攻擊時(shí),肝細(xì)胞內(nèi)DNA將受到損傷[24],大部分細(xì)胞可被核DNA修復(fù)機(jī)制（如核苷酸切除修復(fù)）所修復(fù),少量無法被修復(fù)的細(xì)胞一方面進(jìn)入細(xì)胞周期阻滯發(fā)生DNA復(fù)制衰老,同時(shí)P53正向凋亡調(diào)控因子（P53 upregulated modulator of apoptosis,PUMA）可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,避免肝細(xì)胞發(fā)生惡變[25]。此時(shí)凋亡可清除異常的細(xì)胞,取而代之的是增殖的肝臟細(xì)胞,這一過程有效地維持了肝臟的功能和內(nèi)部的穩(wěn)定。Giorgadze等[26]研究了年齡對(duì)雄性大鼠肝臟凋亡和增生的影響,結(jié)果顯示:和年輕組相比,衰老組中含有多倍染色體細(xì)胞核細(xì)胞的數(shù)量顯著增加。研究者認(rèn)為多倍染色體細(xì)胞的增多將消耗再生的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞,而前者生存具有劣勢(shì);如果含有過多的多倍染色體細(xì)胞,將導(dǎo)致更多的再生肝細(xì)胞被消耗;當(dāng)遭受損傷時(shí),肝臟可能因肝細(xì)胞數(shù)量不足而發(fā)生肝衰竭。此時(shí)異常細(xì)胞凋亡的增多,r可認(rèn)為是對(duì)肝臟的一種保護(hù)。

適度的凋亡可以清除異常細(xì)胞,但是過度的凋亡會(huì)減退正常的生理功能。“氧化應(yīng)激”理論在凋亡的過程中有著重要的地位,涉及caspase和線粒體等多個(gè)環(huán)節(jié)。肝臟衰老伴隨著氧化應(yīng)激的增多,但是肝臟抗氧化能力逐漸下降,這導(dǎo)致氧化應(yīng)激的過度產(chǎn)生。如前所述,ROS的增加可激活P53,從而增強(qiáng)促凋亡蛋白的表達(dá),使凋亡程度升高,加劇衰老肝臟的功能損害。因此,在這種情況下,對(duì)抗過多的氧化應(yīng)激和減少凋亡是對(duì)衰老肝臟的一種保護(hù)策略。越來越多的證據(jù)表明,長(zhǎng)期暴露于超過機(jī)體所能代謝的限量D-半乳糖環(huán)境下,氧化應(yīng)激的產(chǎn)物增多,能產(chǎn)生類似自然衰老的結(jié)果。在D-半乳糖誘導(dǎo)凋亡而發(fā)生衰老的小鼠模型中,黑籽固定油可減少促caspase-3基因的表達(dá),加強(qiáng)caspase-3的裂解[27];虎杖苷在該模型中,能夠改善肝臟衰老的組織學(xué)改變,消除caspase-3的活性,減少ROS的產(chǎn)物和提高抗氧化酶的活性[28];水飛薊油在D-半乳糖誘導(dǎo)老化的小鼠肝臟中可以有效地減輕氧化損傷,改善肝臟細(xì)胞線粒體的功能障礙[29]。可見,在肝臟衰老中,抑制過多的氧化應(yīng)激和凋亡,維持凋亡水平的平衡,能夠緩解因衰老導(dǎo)致的肝臟損傷,改善肝臟受損的功能。

飲食在肝臟衰老中起著保護(hù)作用,其中卡路里限制（caloric restriction,CR）在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中不僅可減緩老化的進(jìn)程,還能延長(zhǎng)壽命。老化過程中,抗氧化能力的下降容易導(dǎo)致ROS水平的增加,l成線粒體DNA損傷和線粒體膜不飽和脂肪酸增多。CR可上調(diào)Beclin-1和Atg-3等自噬基因,激活細(xì)胞內(nèi)自噬活動(dòng),清理氧化損傷的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及受損的線粒體。同時(shí)CR也可通過NRF2/ARE通路增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力,激活質(zhì)膜氧化還原系統(tǒng)（plasma membrane redox system,PMRS）,使線粒體代謝活動(dòng)穩(wěn)定[30]。Ikeyama等[31]在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中研究老化和CR對(duì)促凋亡基因gadd153表達(dá)的影響,以及老化和CR對(duì)氧化損傷的影響。研究結(jié)果顯示,在高濃度的過氧化氫刺激下,gadd153基因被激活,且表達(dá)水平隨著老化的進(jìn)行而增加;gadd153基因使衰老的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞對(duì)氧化性損傷敏感,導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS大量增加,引發(fā)內(nèi)源性凋亡途徑。而CR可以緩解因?yàn)槔匣鴮?dǎo)致的氧化應(yīng)激耐受下降,阻止由于老化而增加的gadd153表達(dá),減輕因氧化應(yīng)激導(dǎo)致的凋亡并且延緩衰老。由此可見,CR在肝臟衰老中,通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、抑制gadd153表達(dá)等方式減輕氧化損傷,并改善因?yàn)楦闻K衰老本身導(dǎo)致的肝臟損傷。細(xì)胞凋亡在肝臟衰老中的作用見圖1。

5 細(xì)胞凋亡在肝臟衰老中的損傷作用

適度的凋亡通常被認(rèn)為是對(duì)肝臟衰老的保護(hù),如果凋亡的平衡被打破,過多或減少的凋亡水平將引起肝臟的損害。就老化過程本身而言,老化可影響內(nèi)源性或外源性凋亡途徑,對(duì)凋亡的平衡產(chǎn)生威脅,損傷肝臟。隨著肝臟老化的進(jìn)行,氧化應(yīng)激逐漸增加,這將消耗大量煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD）,導(dǎo)致肝臟細(xì)胞內(nèi)NAD的減少,從而引發(fā)細(xì)胞中能量的供應(yīng)減少和去乙?；?（sirtuin 1,SIRT1）的功能減退。NAD可作為氫的載體參與ATP的合成。NAD的缺少使細(xì)胞耗盡儲(chǔ)存的ATP,釋放凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor,AIF）,比如細(xì)胞色素c,引發(fā)內(nèi)源性凋亡。由于NAD、SIRT1的不足使P53的脫去乙?；墓δ軠p退,從而使P53活性增強(qiáng),使細(xì)胞對(duì)凋亡更加敏感[32]。對(duì)于線粒體,老化可增強(qiáng)線粒體通透轉(zhuǎn)換孔（mitochon drial permeability transition pore,mtPTP）的活性,引發(fā)促凋亡蛋白從線粒體膜間隙釋放,提高肝臟衰老中凋亡水平[33]。Mach等[34]發(fā)現(xiàn),在衰老的Fischer 344大鼠的肝臟細(xì)胞線粒體中,促凋亡蛋白Bax未發(fā)生改變,然而抗凋亡蛋白Bcl-2減少。這導(dǎo)致Bax和Bcl-2的比值增大,提升了凋亡的水平。因此,老化本身能夠引起線粒體功能障礙,破壞原有的凋亡平衡,進(jìn)而對(duì)肝臟產(chǎn)生損傷。

隨著時(shí)間的變化,細(xì)胞老化中涉及的物質(zhì)逐漸積累。這些積累的物質(zhì)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能等產(chǎn)生影響,并增加損傷和疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[35]。在肝臟老化過程中,由于肝臟的清除能力下降,許多物質(zhì)可在肝臟內(nèi)逐漸積累,鐵元素就是其中一種。Seo等[36]對(duì)年齡分別為8、18、29和37個(gè)月的大鼠進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),肝臟細(xì)胞線粒體內(nèi)的非血紅素鐵含量隨著年齡的增加而增加,導(dǎo)致衰老肝臟mtPTP過度敏感,使mtPTP易開放。在異常濃度的非血紅素鐵的作用下,相對(duì)于年輕組的線粒體,衰老組線粒體內(nèi)的RNA更容易受到氧化損害。然而與DNA損傷不同的是,mtRNA的損傷缺乏相應(yīng)的RNA修復(fù)機(jī)制,導(dǎo)致受損的mtRNA逐漸積累,l成ROS的增加和線粒體的衰老。大量的ROS可激活mTOR,加劇肝臟細(xì)胞的衰老,從而增加肝臟細(xì)胞對(duì)凋亡的易感性,進(jìn)而加速肝臟老化的進(jìn)程。

不能忽視的是,凋亡自身的缺陷也可對(duì)肝臟衰老產(chǎn)生影響。為了探究受損的凋亡功能對(duì)哺乳動(dòng)物老化過程的影響,Zhang等[37]利用caspase-2缺陷的小鼠和野生型小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示在caspase-2缺陷的小鼠肝臟中有更多的蛋白質(zhì)被氧化。而作為半胱氨酸蛋白酶家族的一員,caspase-2通過調(diào)控氧化應(yīng)激來影響凋亡[38],這表明caspase-2的缺乏損傷了肝臟的抗氧化功能。正是因?yàn)閷?duì)抗氧化應(yīng)激的能力減退,使氧化應(yīng)激增多,最后在肝臟衰老的過程中導(dǎo)致氧化損傷[39]。

6 細(xì)胞凋亡在肝臟衰老相關(guān)疾病中的作用

6.1 非酒精性脂肪肝疾病

在肝臟老化過程中,肝臟不僅發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能上的改變,代謝異常的風(fēng)險(xiǎn)也增加。NAFLD（non-alcoholic fatty liver disease）是一類和脂質(zhì)代謝失常有關(guān)的疾病。目前認(rèn)為,NAFLD是在世界范圍內(nèi)分布的肝臟疾病[40],它包含了從簡(jiǎn)單的脂肪變性到非酒精性脂肪肝炎（non-alcoholic steatohepatitis,NASH）的一系列疾病[41]。

NAFLD是在無酒精攝入情況下,由脂質(zhì)的攝取和合成失衡、脂質(zhì)的過多氧化等l成。老化可損傷肝臟對(duì)脂質(zhì)代謝的調(diào)控能力,從而導(dǎo)致脂質(zhì)在肝臟中的積累,即使是在瘦弱的個(gè)體中[42]。在NAFLD中,凋亡被認(rèn)為是加劇其進(jìn)展的因素之一。機(jī)體內(nèi)游離脂肪酸（free fatty acid,FFA）的增多被認(rèn)為是NAFLD發(fā)展至NASH的第一步,隨后的凋亡加速這一過程。在FFA的刺激下,p53基因被激活進(jìn)而導(dǎo)致凋亡發(fā)生。P53通路介導(dǎo)了內(nèi)源性的線粒體凋亡途徑與外源性的死亡受體凋亡途徑。P53可抑制抗凋亡蛋白Bcl-xL,使Bid（BH3 interacting-domain death agonist）裂解為 tBid（truncated Bid）;可增強(qiáng)促凋亡蛋白的表達(dá),比如Bak1和Bax,從而啟動(dòng)線粒體凋亡途徑;也可激活P21,抑制抗凋亡的D細(xì)胞周期蛋白激酶的活性以發(fā)生細(xì)胞周期阻滯;此外,還可上調(diào)Fas、FADD和TRAIL等外源性死亡受體的表達(dá),增強(qiáng)外源性凋亡[43,44]。

由于凋亡在NAFLD中扮演著重要角色,所以凋亡可為NAFLD的診斷和治療提供思路。在診斷NAFLD時(shí),目前主要依靠肝臟的組織切片進(jìn)行病理診斷。但是病理診斷作為一種具有侵襲性的診斷方式,對(duì)機(jī)體損傷較大。凋亡同樣可以提供診斷信息,并且具有無侵襲性等特點(diǎn)。Wieckowska等[45]對(duì)44例NAFLD疑似患者的血漿中肝臟細(xì)胞凋亡水平和caspase-3產(chǎn)生的細(xì)胞角蛋白18（cytokeratin 18,CK18）水平進(jìn)行了檢測(cè),同時(shí)也進(jìn)行了組織切片檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn),和組織切片檢查確診為簡(jiǎn)單脂肪變性的患者的血漿相比,確診為NASH患者的血漿中CK18數(shù)目顯著增多,這提示測(cè)量血漿中細(xì)胞凋亡水平有望成為診斷NAFLD的一種非侵襲性方法。在治療NAFLD方面,Xiao等[46]利用S-烯丙半胱氨酸（S-allylmercaptocysteine,SAMC）應(yīng)對(duì)NAFLD,發(fā)現(xiàn)SAMC可通過抑制凋亡和增加自噬改善NAFLD。SAMC可以激活LKB1/AMPK和PI3K/Akt通路,進(jìn)而抑制處于下游的P53介導(dǎo)的凋亡。SAMC亦可抑制mTOR的活性,增強(qiáng)肝細(xì)胞的自噬。在肝細(xì)胞中,自噬可選擇性地以脂肪滴為目標(biāo),降解脂肪滴,從而減輕肝臟的脂肪變性,這也被稱為脂類自噬（lipophagy）[47]。

6.2 肝纖維化

在肝纖維化（hepatic fibrosis）中,肝臟星形細(xì)胞（hepatic stellate cell,HSC）和其他的成纖維細(xì)胞的活化產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（extracellular matrix,ECM）,比如膠原蛋白。當(dāng)ECM產(chǎn)生的量大于纖溶的量時(shí),肝臟纖維化即發(fā)生。當(dāng)肝臟長(zhǎng)期受到損傷時(shí),肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡而且再生能力被嚴(yán)重削弱,肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡刺激HSC激活CBP/b-catenin通路產(chǎn)生大量ECM,導(dǎo)致肝臟纖維化[48]。由此可見,HSC的活化、肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的凋亡與肝纖維化密切相關(guān)[49]。

目前,應(yīng)對(duì)肝纖維化的主要策略是促使HSC老化和凋亡。例如,白介素-22（interleukin-22,IL-22）通過IL-22受體1（IL-22R1）和IL-10受體2（IL-10R2）,激活HSC內(nèi)的STAT3,后者進(jìn)一步激活細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制物（suppressor of cytokine signaling,SOCS）,SOCSr上調(diào)P53和P53的靶基因如p21、GADD45a、PMP22,導(dǎo)致 HSC 發(fā)生 G1期阻滯,最終l成HSC衰老并緩解肝纖維化[50]。需要指出,HSC的老化并不意味著肝臟整體的老化。肝臟整體衰老對(duì)于肝纖維化的緩減不僅無幫助,甚至?xí)由罡卫w維化的嚴(yán)重程度。肝臟衰老時(shí)纖維變得濃厚,賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase,LOX）表達(dá)增強(qiáng),使膠原不易被降解;同時(shí),肝臟衰老伴隨著纖維降解能力的減退。這些均提示肝臟衰老加劇肝纖維化程度[51]。此外,因老化而增加的氧化應(yīng)激也對(duì)肝纖維化的進(jìn)展有促進(jìn)作用[52]。由此可見,細(xì)胞凋亡起著雙刃劍作用。肝臟衰老本身作為肝纖維化的危險(xiǎn)因素,對(duì)肝臟纖溶能力產(chǎn)生損傷。隨之而來的細(xì)胞凋亡,一方面使HSC死亡,減少肝臟纖維的產(chǎn)生,緩解肝纖維化的程度[53];而另一方面,又可使肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡,肝臟再生能力被打擊,擴(kuò)大ECM的分布,加劇肝纖維化。所以,在保護(hù)肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的基礎(chǔ)上,增強(qiáng)HSC老化或者凋亡,將是應(yīng)對(duì)肝纖維化的有效方法。

6.3 肝硬化

肝硬化（cirrhosis）以廣泛的纖維組織在肝臟堆積為特點(diǎn),可由肝纖維化進(jìn)一步發(fā)展而來,被認(rèn)為是晚期的肝纖維化[54]。晚期肝硬化通常不可逆轉(zhuǎn),并且有向肝細(xì)胞癌發(fā)展的惡性傾向[55],因此肝硬化常常被認(rèn)為是一種癌前狀態(tài)。

端?？s短在肝硬化中表現(xiàn)尤為明顯,并且和肝纖維化演變成肝硬化有緊密的聯(lián)系[56]。肝臟在慢性有害因素刺激下,比如酒精攝入、肥胖、病毒性肝炎等,肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞受到損害,肝臟為彌補(bǔ)受損的細(xì)胞而加速肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的再生。肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞DNA持續(xù)復(fù)制,進(jìn)而導(dǎo)致端?？s短,而后者在限制其再生能力的同時(shí),也使P53被激活。P53可激活P21,抑制細(xì)胞周期素依賴激酶（cyclin-dependent kinase,CDK）的磷酸化作用并阻止視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因（retinoblastoma gene,Rb gene）表達(dá),導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在G1期發(fā)生阻滯,進(jìn)而使其衰老[57]。端?？s短也可誘導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生以P53為主導(dǎo)的凋亡[58]。以上都可激活HSC產(chǎn)生大量纖維,破壞肝臟結(jié)構(gòu)形成假小葉并且發(fā)生肝功能紊亂[54]。

在縱向研究中,衰老被發(fā)現(xiàn)是肝硬化發(fā)展到肝細(xì)胞癌的危險(xiǎn)因素[59]。然而,肝硬化導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的機(jī)制目前仍不明確?，F(xiàn)有的資料表明,肝細(xì)胞癌來源于肝臟的卵2細(xì)胞。Xu等[60]運(yùn)用二乙基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝硬化,并在該模型中發(fā)現(xiàn)大量肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡,推測(cè)肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的凋亡可能刺激卵2細(xì)胞增殖,因而顯著地增加了肝硬化發(fā)展成肝細(xì)胞癌的概率。

類似于肝纖維化,應(yīng)對(duì)肝硬化時(shí),HSC凋亡成為關(guān)鍵靶點(diǎn)。廣泛的纖維組織主要由HSC和血管周圍的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生,二者統(tǒng)稱為肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast）。Kim等[61]在大鼠肝硬化動(dòng)物模型中研究發(fā)現(xiàn),肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor,HGF）可結(jié)合肌成纖維細(xì)胞表面的c-Met受體,抑制其DNA合成,降低肌成纖維細(xì)胞的增殖。同時(shí)HGF還可增強(qiáng)肌成纖維細(xì)胞內(nèi)Fas受體的表達(dá),使其發(fā)生由Fas受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,從而緩解肝硬化,這表明促進(jìn)肝臟肌成纖維細(xì)胞凋亡是應(yīng)對(duì)肝硬化的有效舉措。

6.4 肝癌

腫瘤的發(fā)生是一個(gè)與細(xì)胞凋亡和衰老減少密切相關(guān)的長(zhǎng)期過程[62],肝癌也不例外。在遺傳因素、環(huán)境因子和乙肝病毒等攻擊下,肝臟細(xì)胞內(nèi)DNA將產(chǎn)生損傷。此時(shí)肝臟內(nèi)的ATM（ataxia telangiectasia mutated）和ATR（ataxia telangiectasia and Rad3 related）可檢測(cè)損傷,并分別磷酸化檢查點(diǎn)激酶2（checkpoint kinase 2,Chk2）和檢查點(diǎn)激酶1（checkpoint kinase 1,Chk1）,二者可以激活P53。DNA輕度損傷時(shí),p53轉(zhuǎn)錄Fen1、XPC等抑癌基因修復(fù)受損的DNA;而DNA嚴(yán)重受損時(shí),p53轉(zhuǎn)錄Bax、Fas-R等促凋亡基因誘導(dǎo)受損細(xì)胞凋亡[63]。DNA損傷也可激活P53-P21-pRb和P16-pRb等衰老相關(guān)通路,導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和端?？s短,發(fā)生DNA復(fù)制衰老,進(jìn)而限制細(xì)胞增殖[25,64]。因此,凋亡和衰老可以使受損細(xì)胞避免癌變,維持肝臟內(nèi)的穩(wěn)定狀態(tài)[65]。當(dāng)受損的肝臟細(xì)胞逃脫衰老或凋亡時(shí),細(xì)胞內(nèi)受損的DNA積累r可能導(dǎo)致細(xì)胞癌變。

如上所述,肝癌是由受損的肝臟細(xì)胞逃脫衰老和凋亡所引起的,因此觸發(fā)肝癌細(xì)胞衰老和凋亡是重要的抑癌策略。化療藥物如環(huán)磷酰胺可損傷腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA,同時(shí)激活依靠P53和P16的衰老通路,使腫瘤細(xì)胞發(fā)生衰老,抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[66]。轉(zhuǎn)錄因子Foxa1（Forkhead box A1）和FoxO3a（Forkhead box O3a）可通過調(diào)節(jié)Bcl-2增加肝癌細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[67,68]。阿司匹林作為一種非甾體抗炎藥,在肝細(xì)胞癌中,可激活caspase活性、影響B(tài)ax/Bcl-2比值等內(nèi)源性和外源性的凋亡途徑,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抗癌的作用[69]。當(dāng)阿司匹林和阿霉素聯(lián)用時(shí),能夠產(chǎn)生協(xié)同促凋亡作用,誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌的癌細(xì)胞發(fā)生凋亡,抑制腫瘤的生長(zhǎng)[70]。另外,一部分中藥也是通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌的控制與治療[71]。

7 總結(jié)和展望

肝臟作為機(jī)體中重要的代謝器官,其功能和狀態(tài)對(duì)健康的影響是無可替代的。隨著老齡化社會(huì)的到來,肝臟衰老已經(jīng)對(duì)人類健康產(chǎn)生威脅,因此明確細(xì)胞凋亡對(duì)肝臟衰老的影響有重要意義。當(dāng)遭遇來自內(nèi)源性或外源性的應(yīng)激刺激時(shí),肝臟細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等受到損害并激活P53,P53可介導(dǎo)細(xì)胞自噬清理受損的蛋白質(zhì)和線粒體等;對(duì)于受損的DNA,一方面細(xì)胞內(nèi)核苷酸切除修復(fù)等機(jī)制可對(duì)其進(jìn)行修復(fù),另一方面亦可通過P53/P21等通路使細(xì)胞進(jìn)入G1期阻滯而發(fā)生DNA復(fù)制衰老,或由P53增強(qiáng)促凋亡蛋白如Bax誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。對(duì)于逃脫衰老和凋亡的細(xì)胞而言,肝臟細(xì)胞內(nèi)受損DNA的逐漸積累可導(dǎo)致細(xì)胞癌變。因此,衰老和凋亡可被認(rèn)為是細(xì)胞兩種重要的抑癌途徑。在老年性肝病中,如非酒精性脂肪肝疾病、肝纖維化、肝硬化和肝癌等,細(xì)胞凋亡不但和這些疾病的發(fā)生與演變密切相關(guān),而且可為這些疾病提供治療思路和策略。例如,肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡是肝纖維化的成因之一,而誘導(dǎo)HSC凋亡r是解決肝纖維化的關(guān)鍵。此外,細(xì)胞凋亡自身又是一個(gè)復(fù)雜的過程,是否發(fā)生凋亡可能和應(yīng)激程度及細(xì)胞種類等有關(guān)。因此,現(xiàn)階段仍需要更多細(xì)胞凋亡和肝臟衰老相關(guān)性的研究,以進(jìn)一步闡明這二者的關(guān)系,從而為將來更好治療臨床肝臟衰老相關(guān)問題和相關(guān)疾病提供依據(jù)。