歐陽燦,黃 慧,唐 芳,周 征

（湖南大學生物學院,中國湖南長沙410082）

活細胞的基因組每天都會產(chǎn)生數(shù)以萬記的損傷,細胞自身的代謝產(chǎn)物和外部的物理、化學因素都可以損傷DNA。例如:細胞正常代謝產(chǎn)生的活性氧類（reactive oxygen species,ROS）可使鳥嘌呤（G）氧化成8-氧鳥嘌呤（8-oxoG）,8-oxoG不再與胞嘧啶（C）配對,而與腺嘌呤（A）配對,最終使DNA鏈上的G-C轉(zhuǎn)換成T-A,從而導致DNA上堿基的突變[1]。外源的紫外光照射會使DNA同一條鏈上相鄰的兩個嘧啶（以TT最為常見）以共價鍵的形式形成環(huán)丁烷嘧啶二聚體（CPD）或嘧啶（6-4）光產(chǎn)物二聚體（6-4PP）[2]。生物在進化過程中,為了維持遺傳信息的穩(wěn)定,細胞內(nèi)逐步演化出了一套能感應識別DNA損傷,傳遞DNA損傷信號,激活細胞周期檢驗點,引發(fā)細胞周期阻滯,促進DNA損傷修復或者啟動凋亡程序（當損傷不能修復時）的DNA損傷應答（DNA damage response,DDR）機制[3]。若細胞內(nèi)DDR機制存在缺陷,將有可能導致基因組的不穩(wěn)定,從而引發(fā)神經(jīng)退行性疾病、癌癥、免疫缺陷等相關(guān)疾病[4]。因此,DDR研究已成為生命科學研究的熱點和前沿方向之一。對DDR的研究有助于更深入地理解細胞應對各種DNA損傷脅迫的反應,以及癌癥等疾病發(fā)生、發(fā)展的機理,從而為這些疾病的治療提供理論指導和個性化治療方案。

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,lncRNA）是一類長度大于200個核苷酸且不具有編碼能力的RNA分子。與信使RNA（mRNA）類似,大部分lncRNA也是由RNA聚合酶域催化合成,且具有5,帽子和3,poly（A）的尾巴[5,6]。根據(jù)轉(zhuǎn)錄出長鏈非編碼RNA的DNA片段與靶標蛋白質(zhì)編碼基因之間的相對位置,一般將lncRNA分為五類:同義 lncRNA、反義 lncRNA、內(nèi)含子 lncRNA、雙向lncRNA和基因間lncRNA[7]。隨著測序技術(shù)的發(fā)展,越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)。NONCODE數(shù)據(jù)庫是非編碼RNA領(lǐng)域的專業(yè)數(shù)據(jù)庫,記錄了至少17萬種lncRNA。研究表明lncRNA具有多種功能,能通過與蛋白質(zhì)、RNA、DNA相互作用參與多種生物學過程,如細胞增殖分化[8]、多能性維持[9]、DDR[10]等。而且lncRNA轉(zhuǎn)錄及調(diào)控的異常是導致基因不穩(wěn)定和許多疾病發(fā)生、發(fā)展的重要機制。例如:在原發(fā)性乳腺癌和轉(zhuǎn)移癌中,人們鑒定了一種高表達lncRNA-HOTAIR,它通過與PRC2（polycomb repressive complex 2）復合物結(jié)合將該復合物引入到特定的靶基因上（其中包括乳腺癌抑制基因,如HOXD10、JAM2、EPHA1）,導致組蛋白 H3第27位賴氨酸甲基化,抑制靶基因的表達,從而有利于腫瘤的侵襲和遷移[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)在亨廷頓舞蹈癥患者體內(nèi)HAR1、NEAT1和DGCR5等lncRNA的轉(zhuǎn)錄發(fā)生了變化[12]。因此鑒定更多參與DDR的lncRNA,探索它們在DDR中發(fā)揮的功能,能加深我們對DDR機制理解的深度和廣度,更能全面掌握某些疾病發(fā)生、發(fā)展的機理,為臨床治療提供理論指導和依據(jù)。

1 引起細胞DDR的脅迫能誘導lncRNA轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化

引起細胞DDR的脅迫通常是基因組上的DNA損傷,一些治療癌癥的藥物也會l成DNA損傷而誘發(fā)DDR,如阿霉素、博來霉素、順鉑、依托泊苷等。其中,依托泊苷為細胞周期特異性抗腫瘤藥物,它通過形成一種藥物-拓樸異構(gòu)酶域-DNA的復合物,導致DNA單鏈或雙鏈斷裂;而順鉑r與DNA形成交叉聯(lián)結(jié)引發(fā)同一條DNA鏈或不同DNA鏈交聯(lián)[13]。細胞應答DNA損傷時需要多個通路參與,因而應答不同物質(zhì)引起的脅迫,細胞會啟動不同的通路且需要不同的功能因子參與。lncRNA是最新發(fā)現(xiàn)的參與DDR的功能因子,也是了解最少的DDR功能因子。

研究表明細胞在應答DNA損傷時,許多l(xiāng)ncRNA的轉(zhuǎn)錄會發(fā)生變化。其中部分lncRNA的轉(zhuǎn)錄是由DNA損傷發(fā)生后激活的P53、E2F1等轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控的。Sanchez等[14]通過RNA-seq和P53-ChIP-seq對受到DNA損傷后的人體癌細胞進行分析,新發(fā)現(xiàn)了18條受P53調(diào)控的lncRNA,其中有兩條已經(jīng)證實參與調(diào)節(jié)了P53通路,促進了DNA損傷誘導的細胞凋亡。另有研究發(fā)現(xiàn)數(shù)條lncRNA的啟動子區(qū)域或轉(zhuǎn)錄起始位點下游包含有P53的結(jié)合位點,如lincRNA-p21、lincRNA-Mkln1、PANDA、TUG1、PVT1。當細胞經(jīng)過DNA損傷誘導劑處理產(chǎn)生DNA損傷后,P53直接與其結(jié)合誘導這些lncRNA的轉(zhuǎn)錄[15～18]（圖1）。相關(guān)報道顯示,部分lncRNA受P53的間接調(diào)控,如lncRNALINP1在過表達P53的乳腺癌細胞和結(jié)直腸癌細胞中的表達明顯降低,且在其轉(zhuǎn)錄區(qū)域并沒有P53結(jié)合位點,但是在其第2個外顯子區(qū)域有miR-29的結(jié)合位點,研究人員推測可能是P53通過調(diào)控miR-29間接調(diào)節(jié)LINP1的轉(zhuǎn)錄[19]（圖1）。另外,研究人員還發(fā)現(xiàn)用新制癌菌素、依托泊苷、博來霉素處理U2OS細胞后,轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子E2F1與ANRIL基因的啟動子結(jié)合增加,從而促進了lncRNAANRIL的轉(zhuǎn)錄[20]（圖1）。這些研究均表明DNA損傷發(fā)生之后,細胞在應答DNA損傷時,許多l(xiāng)ncRNA的轉(zhuǎn)錄發(fā)生了變化,某些lncRNA的轉(zhuǎn)錄變化就是DDR的組成部分,但是哪些lncRNA參與了DDR、在DDR中起了何種作用還有待進一步的研究。

2 lncRNA通過不同的途徑參與DDR

細胞應答DNA損傷時,轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化的部分lncRNA通過不同的方式參與DDR,如調(diào)節(jié)DDR功能因子的表達、參與DDR中的信號傳遞或直接調(diào)控DNA修復過程。

2.1 lncRNA通過調(diào)節(jié)DDR功能因子的表達來參與DDR

已知的DDR功能因子絕大多數(shù)是蛋白質(zhì),根據(jù)其在DDR中發(fā)揮的作用可分為感應因子、傳遞因子和效應因子三類[21]。感應因子是能識別異常DNA結(jié)構(gòu)并激活上游激酶的一些蛋白質(zhì),如PARP1、MRE11/RAD50/NBS1等;傳遞因子主要是蛋白激酶級聯(lián)反應中的一些蛋白質(zhì),如ATM（ataxia telangiectasia mutated）、ATR（ataxia telangiectasia and Rad3 related）以及DNA-PK（DNA-dependent protein kinase）等;效應因子r是參與DDR的蛋白激酶底物和修復DNA損傷的蛋白質(zhì),這些因子直接參與DNA復制、DNA修復、細胞周期控制和凋亡等過程,如P53、E2F1等[21,22]。

研究表明lncRNA可以通過調(diào)節(jié)DDR中不同功能因子的表達來參與DDR。lncRNACRNDE作為miR-136的競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）,以誘餌的方式吸附miR-136并與其結(jié)合,減少miR-136與E2F1 mRNA的結(jié)合,進而促進轉(zhuǎn)錄因子E2F1的表達,后者可增強結(jié)直腸癌細胞對奧沙利鉑（一種鉑類抗癌藥）的耐藥性,減少DNA損傷誘導的細胞凋亡[23]。lncRNABARD1 9,L同樣以ceRNA方式發(fā)揮功能。它由BARD1基因第9個內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄而來,BARD1 mRNA包含多個剪切異構(gòu)體,參與了多種細胞過程如DNA修復、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色質(zhì)重塑等。BARD1 9,L與具有蛋白質(zhì)編碼功能的BARD1 mRNA共享部分3,-UTR區(qū)域,能競爭性地與miR-203和miR-101結(jié)合,而miR-203和miR-101能與BARD1 mRNA結(jié)合,因而BARD1 9,L抑制了miR-203和miR-101對BARD1 mRNA的負調(diào)控作用[24]。另外,研究發(fā)現(xiàn)在DDR過程中細胞周期調(diào)控因子CCND1的表達受到抑制。當電離輻射使DNA發(fā)生損傷后,lncRNACCND1會在CCND1基因的啟動子處被啟動轉(zhuǎn)錄,隨后它將與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase,HAT）抑制劑TLS（translocated in liposarcoma）結(jié)合并定位到CCND1基因的調(diào)控區(qū)域。TLS的N末端可以與CBP（CREB-binding protein）和p300結(jié)合,從而抑制CBP/p300-HAT復合物的活性,最終抑制CCND1基因的表達[25],從而導致細胞周期停滯（圖1）。lncRNATODRA由RAD51上游69 bp處反向轉(zhuǎn)錄而來。RAD51是DSB（double-strand break）修復及同源重組修復中的修復因子,也是DDR中重要的功能因子,其表達失調(diào)會導致基因組的不穩(wěn)定,從而引發(fā)癌癥。TODRA與RAD51由同一個啟動子啟動轉(zhuǎn)錄,該啟動子區(qū)域包含一個E2F1結(jié)合位點,雙向調(diào)控TODRA與RAD51的表達;在癌細胞中,TODRA會促進TPIP（TPTE家族的一員,編碼PTEN相關(guān)的酪氨酸激酶）的表達,而TPIP會與E2F1相互作用誘導RAD51的表達[26]。此外,lncRNA還能通過調(diào)節(jié)DDR中的某些功能因子來催化DDR中組蛋白的修飾。Wan等[27]發(fā)現(xiàn)DNA損傷會誘導組蛋白H4第5位、第8位、第12位賴氨酸發(fā)生乙?；?這種乙酰化主要受jade1-HBO1復合物催化,而lncRNAJADE可以作為一個支架分子招募CBP/p300和BRCA1蛋白,進而激活jade1基因的轉(zhuǎn)錄（圖1）。

2.2 lncRNA參與DDR的信號傳遞

DDR網(wǎng)絡包含了一系列激酶級聯(lián)反應。在已知的激酶應激網(wǎng)絡中,ATM、ATR以及DNA-PK這3種激酶被認為是DNA損傷確認后細胞應答的發(fā)起者,它們分別擁有數(shù)百種蛋白質(zhì)底物,可以使靶標蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化修飾,進而激活靶標蛋白質(zhì),如P53、BRCA1等,而P53和BRCA1這些蛋白質(zhì)又調(diào)控許多DDR功能因子的轉(zhuǎn)錄,從而形成復雜的信號傳遞網(wǎng)絡[28]。ATM-P53信號通路是DDR反應的主要通路之一。研究發(fā)現(xiàn)部分lncRNA能通過調(diào)節(jié)P53信號通路,進而調(diào)控DDR中細胞周期的進程等,如基因間區(qū)長鏈非編碼RNA（large intergenic ncRNA,lincRNA）LIRR1。在細胞經(jīng)電離輻射后,LIRR1會引起P53活化進而誘導p21表達,抑制細胞周期依賴性激酶2（cyclin-dependent kinase 2,Cdk2）,導致細胞周期停滯在G1期,從而參與和調(diào)控P53介導的DDR通路[29]。有研究發(fā)現(xiàn),lncRNAROR的轉(zhuǎn)錄在結(jié)直腸癌細胞中顯著升高,而敲降lncRNAROR會引發(fā)G0/G1的細胞周期停滯,促進細胞凋亡,從而顯著抑制細胞增殖和生存能力。進一步研究證實lncRNAROR與核內(nèi)不均一核糖核蛋白Ⅰ（heterogeneous nuclear ribonucleoproteinⅠ,hnRNPⅠ）相互作用,從而顯著降低DNA損傷誘導的P53表達,進而抑制DDR中P53介導的信號通路[30]（圖1）。DNA損傷誘導產(chǎn)生的另一種lncRNADINO在細胞應答DNA損傷時會與P53結(jié)合,穩(wěn)定P53蛋白活性并促進P53調(diào)控的靶基因表達,從而調(diào)節(jié)P53介導的DDR反應[31]。而lincRNA-p21與hnRNP-K （heterogeneous nuclear ribonu cleoprotein K）結(jié)合,通過調(diào)控hnRNP-K的定位,抑制P53下游部分基因的表達來調(diào)控P53介導的信號通路,從而誘導細胞凋亡[15]（圖1）。此外,研究發(fā)現(xiàn)lincRNA-p21能通過與MDM2（一種E3泛素連接酶）結(jié)合減少MDM2對P53的抑制作用,增強p300與P53的相互作用 （p300使P53乙?；?進而增強P53的轉(zhuǎn)錄活性[32]（圖1）。

lncRNA還可以與DDR信號傳導中的其他功能因子相互作用,調(diào)控信號傳遞結(jié)果來參與DDR。當用阿霉素處理成纖維細胞時,lncRNAPANDA通過誘捕核轉(zhuǎn)錄因子NF-YA（一個DDR的功能因子）來阻止后者與靶基因的結(jié)合,從而抑制NF-YA對凋亡基因的激活[33]（圖1）。gadd7是一條長754個核苷酸的多腺嘌呤lncRNA,其過表達會抑制細胞的生長。相關(guān)研究報道,紫外照射倉鼠卵巢細胞后,lncRNAgadd7的轉(zhuǎn)錄發(fā)生顯著變化。進一步研究顯示,紫外照射誘導產(chǎn)生的gadd7直接與TAR（DNA結(jié)合蛋白）相結(jié)合,干擾TAR與細胞周期蛋白依賴性激酶6（cyclin-dependent kinase 6,Cdk6）mRNA的相互作用,導致Cdk6 mRNA的降解,使細胞停滯在G1期,讓細胞有足夠時間修復DNA損傷并防止細胞在修復DNA損傷前進行DNA 復制[34]（圖 1）。

2.3 lncRNA直接調(diào)控DNA損傷的修復過程

DNA損傷修復是將受損的DNA恢復正常,維持遺傳信息相對穩(wěn)定的過程,是維持生命穩(wěn)定存在的重要保證。由于許多因素都能損傷DNA,因此DNA損傷類型種類繁多。針對不同的DNA損傷類型,DNA損傷修復機制大致可分為以下幾種:核苷酸切除修復（nucleotide excision repair,NER）、堿基切除修復（base excision repair,BER）、雙鏈斷裂修復[包括同源重組（homologous recombination,HR）修復和非同源末端連接（non-homologous end joining,NHEJ）修復]、錯配修復（mismatch repair,MMR）、DNA 鏈間交聯(lián)修復（interstrand crosslink repair,ICL repair）以及直接修復（direct repair）等[35]。

研究發(fā)現(xiàn)lncRNA能直接調(diào)控DNA損傷的修復。如:當DNA發(fā)生雙鏈斷裂損傷后,受ATMNF-kB通路調(diào)控,細胞受激轉(zhuǎn)錄出 lncRNADDSR1。隨后DDSR1通過與BRCA1、hnRNPUL1相互作用,募集BRCA1和RAP80進入到斷裂的DNA末端,調(diào)控斷裂DNA末端的切除,從而促進DNA雙鏈斷裂損傷通過HR通路修復[36]（圖1）。而lncRNALINP1在DNA發(fā)生雙鏈斷裂損傷后,可以通過分子支架的形式連接Ku80與DNA-PKcs形成修復復合物,即5,結(jié)構(gòu)域連接Ku80,3,結(jié)構(gòu)域連接DNA-PKcs,從而啟動NHEJ修復通路,實現(xiàn)DNA損傷修復[37]（圖1）。

3 lncRNA在基因組穩(wěn)定性中發(fā)揮作用

基因組的不穩(wěn)定性是癌癥發(fā)生的重要因素,除了DNA序列的突變,還包括染色體的重排與染色體的非整倍性等。Lee等[38]在用阿霉素處理結(jié)直腸癌細胞后,發(fā)現(xiàn)了一條依賴P53通路激活的非編碼RNA,將其命名為NORAD。進一步研究證實當用阿霉素處理細胞使DNA受到損傷后,NORAD將作為誘餌捕獲PUMILIO蛋白并與其結(jié)合,減少PUMILIO蛋白對有絲分裂、DNA復制、DNA損傷修復等相關(guān)靶mRNA的抑制作用,從而使細胞的有絲分裂正常進行,維持了染色體的整倍性（圖1）。端粒在保持染色體的完整性和控制細胞生長等方面起著至關(guān)重要的作用,而端粒蛋白復合體組分TRF2丟失會使端粒功能失調(diào),導致染色體融合而改變?nèi)旧w的整倍性。研究表明在TRF2缺失的細胞中,lncRNATERRA的轉(zhuǎn)錄會上調(diào),且通過UUAGGG重復序列與SUV39H1組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的N端結(jié)構(gòu)域相結(jié)合,增加甲基化的H3K9在受損端粒的積累,進而促進端粒末端的融合,影響基因組的穩(wěn)定性[39,40]（圖1）。

4 結(jié)語和展望

綜上所述,lncRNA可能在DDR中扮演了許多重要的角色,發(fā)揮著關(guān)鍵作用,只是目前知之甚少。

一方面在應對DNA損傷時,許多l(xiāng)ncRNA的轉(zhuǎn)錄會發(fā)生變化,目前確認功能的僅僅是極少的一部分。Nie等[41]發(fā)現(xiàn)在用X射線處理人支氣管上皮細胞后有115條lncRNA的表達上調(diào),通過生物信息預測,它們可能參與了P53信號通路,然而其具體的功能及作用機制還有待進一步研究。Cd會引發(fā)DNA損傷、降低DNA修復能力并促進細胞凋亡,Zhou等[42]用CdCl2處理人支氣管上皮細胞后發(fā)現(xiàn)有369條lncRNA表達上調(diào),90條lncRNA表達下調(diào),其中僅證實lncRNAENST00000414355被敲降后,會抑制損傷細胞的生長、下調(diào)DNA損傷相關(guān)基因的表達并上調(diào)DNA修復相關(guān)基因的表達。

另一方面已知功能的lncRNA能通過多種途徑參與DDR的多個過程,說明可能在DDR的各個環(huán)節(jié)中都有l(wèi)ncRNA參與。此外,lncRNA失調(diào)與缺陷的DDR都與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān),因此越來越多l(xiāng)ncRNA的功能被挖掘,必將豐富我們的治療手段、提高治療的效率、獲得更多有效的藥物。

總之,深入揭示lncRNA在DDR中的功能和其參與DDR的分子機理,不僅能深化和豐富DDR的理論知識,而且能極大加深我們對與之相關(guān)疾病發(fā)病機理的理解,更能在理論上指導臨床治療和藥物研發(fā)。