彭喬木，周璐璐，熊 力，彭清忠，胡 廣

(1.長沙醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410219；2.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000)

吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline Quinone,PQQ)是20世紀70年代末發(fā)現(xiàn)的一種氧化還原酶的新輔酶，是繼黃素核苷酸(FMN，F(xiàn)AD)和煙酰胺核苷酸(NAD，NADP)之后發(fā)現(xiàn)的第3種輔酶.[1]PQQ類似水溶性B族維生素，廣泛存在于水果、蔬菜、谷物和飲品等食物中，其質(zhì)量濃度范圍在3.65～61.0 μg/L[2].缺乏PQQ的實驗小鼠出現(xiàn)繁殖能力低下的現(xiàn)象[3]，推測它對人類也有類似的影響.人乳中PQQ及其衍生物TPQ(Topaquinone)總質(zhì)量濃度達140～180 μg/L，比一般食物(如蔬菜和肉類)的PQQ含量高幾十倍[4]，暗示該物質(zhì)對嬰幼兒的生長發(fā)育起至關(guān)重要的作用.PQQ還具有抗腫瘤、清除自由基、解毒消炎、神經(jīng)細胞的修復(fù)和抗II型糖尿病等功能.[5-6]

目前，PQQ主要來源是化學(xué)合成，步驟繁瑣、產(chǎn)率低、提純困難，應(yīng)用于藥物或食品添加劑成本高，不適于推廣.相比之下，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)PQQ具有步驟少、周期短、成本低等優(yōu)勢，是未來PQQ工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展方向.研究表明，PQQ由某些革蘭氏陰性菌以谷氨酸和酪氨酸為底物合成，作為葡萄糖脫氫酶、乙醇脫氫酶和甲醇脫氫酶的輔酶而存在[7].在能合成PQQ的革蘭氏陰性菌中，一些細菌產(chǎn)生極少量PQQ，供其自身代謝所需，如惡臭假單胞菌(Pseudomonasputidasp)[8]；另外一些細菌，如甲基利用型細菌(Methanol-utilizing bacteria)，野生菌株產(chǎn)PQQ量約為2～3 mg/L，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件可達每升幾毫克至幾十毫克[9-11].但總的來說，微生物菌株產(chǎn)PQQ的量仍然較低.為了實現(xiàn)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)PQQ，有必要開展以下工作：首先，篩選產(chǎn)PQQ量較高的微生物菌株，并開展遺傳育種；其次，通過基因工程手段構(gòu)建生物合成PQQ的工程菌，通過發(fā)酵提高PQQ產(chǎn)量.基于此，筆者利用甲醇為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基富集篩選嗜甲基營養(yǎng)菌，然后通過多輪PCR擴增，克隆pqq基因簇的全長基因，并進行其結(jié)構(gòu)和生物信息學(xué)分析，為下一步構(gòu)建高產(chǎn)PQQ的工程菌以及研究其生物合成機制提供理論和實驗基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

土壤樣品：采集湖南省永順縣小溪國家自然保護區(qū)森林腐殖質(zhì)土壤.

試劑：LATaq酶、pMD18-T載體、PCR產(chǎn)物回收試劑盒，以及其他分子生物學(xué)試劑均購自大連寶生物有限公司；引物合成及目的基因測序由上海生工生物工程有限公司完成；其他化學(xué)試劑均為分析純.

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：KH2PO42.5 g/L，MgSO40.2 g/L，NH4NO33.0 g/L，F(xiàn)e2SO40.1 g/L，K2HPO42.0 g/L，CH3OH 10 mL，蒸餾水1 000 mL.篩選培養(yǎng)基：MgSO41.5 g/L，(NH4)2SO43.0 g/L，KH2PO41.4 g/L，Na2HPO43.0 g/L，檸檬酸鐵30 mg/L，CaCl2·2H2O 30 mg/L，MnCl2·4H2O 0.5 mg/L，ZnSO4·7H2O 5 mg/L，CuSO4·5H2O 0.5 mg/L，CH3OH 10 mL，1.5%瓊脂，蒸餾水1 000 mL.LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂15 g/L，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.0.

1.3 嗜甲基營養(yǎng)菌的篩選與分離

稱取土壤樣品10 g，加入90 mL無菌水，120 r/min振蕩1 h使土樣充分混勻.取1 mL土壤懸液加入富集培養(yǎng)基中，28 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 d.取7根試管，依次標記A—G，并向每管中注入9 mL雙蒸水，然后取1 mL富集培養(yǎng)液加入A管的無菌水中，制成10-1的稀釋液；從A管稀釋液中吸取1 mL液體加入B管的9 mL無菌水中，制成10-2稀釋液；……依此類推，制成10-4～10-7的稀釋液.分別吸取1 mL的D—G中的10-4～10-7梯度稀釋懸液，用玻璃涂布棒均勻涂布在篩選培養(yǎng)基平板上.每個梯度稀釋液涂布3塊平板，分別編號，放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d.每隔1 d觀察平板中微生物生長情況，當(dāng)平板上出現(xiàn)均勻分布且長勢良好的單菌落時，挑取單菌落在LB固體培養(yǎng)基上進行四分區(qū)劃線.為達到純化目的，每株菌傳代3次，選取其中長勢良好的菌株保存?zhèn)溆?

1.4 細菌16S rRNA基因的擴增和菌株鑒定

采用CTAB/NaCl法提取細菌基因組DNA做為模板，用細菌16S rRNA基因的通用引物F27和R1492為擴增引物.配置50 μL的PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer (5 μL)，dNTP Mixture (0.4 μL)，正向引物 (0.4 μL)，反向引物 (0.4 μL)，基因組DNA (2.0 μL)，LATaq酶 (0.1 μL)，ddH2O (41.7 μL).PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，共30個循環(huán)，72 ℃ 10 min.瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，配置的瓊脂糖凝膠質(zhì)量分數(shù)為1.2%.檢測合格的PCR產(chǎn)物送大連寶生物有限公司測序.

根據(jù)測序結(jié)果，采用BLAST搜索程序從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載相似性較高的相關(guān)菌株的16S rRNA基因序列，用CLUSTAL-X軟件進行16S rRNA基因序列多重比對，然后根據(jù)Kimura模型估算系統(tǒng)進化距離矩陣，再使用MEGA 5.2軟件，以鄰接法(Neighbor-Joining)進行聚類分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建.結(jié)合菌株形態(tài)特征，將其初步鑒定到屬水平.

1.5 pqq基因簇引物設(shè)計及全長pqq基因的克隆

在GenBank數(shù)據(jù)庫中下載8株細菌的pqq基因簇序列pqqB，pqqC，pqqD和pqqE，使用CLUSTAL-X軟件進行序列多重比對.根據(jù)比對分析結(jié)果，選取堿基序列高度保守的片段作為引物設(shè)計靶標，首先設(shè)計2對引物pqqB-F和pqqC-R，pqqC-F和pqqE-R(表1)，利用這2對引物進行PCR擴增.配置PCR反應(yīng)體系 (50 μL)：10×PCR buffer (5 μL)，dNTP Mixture (0.4 μL)，正向引物 (0.4 μL)，反向引物 (0.4 μL)，基因組DNA (2.0 μL)，LATaq(0.1 μL)，ddH2O (41.7 μL).PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 5 min，共30 個循環(huán)，72 ℃ 10 min.經(jīng)上述PCR擴增，獲得篩選菌株的部分pqq基因簇片段序列.擴增產(chǎn)物送大連寶生物有限公司測序.

將測序結(jié)果送GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對分析.選取與擴增片段的pqq基因簇核苷酸序列同源性最高的序列為模板，設(shè)計引物pqqA-F和pqqF-R(表1)，利用這對引物，配置相應(yīng)的PCR反應(yīng)體系，擴增篩選菌株的pqq基因簇全長序列，并對該全長序列進行測序分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 嗜甲基營養(yǎng)菌的篩選及其系統(tǒng)發(fā)育分析

通過富集、篩選，純化獲得了26株嗜甲基營養(yǎng)菌，筆者選取其中長勢最好的一株嗜甲基營養(yǎng)細菌(編號NH8)開展后續(xù)研究工作.形態(tài)觀察NH8菌株菌落凸起、中心不透明、邊緣不規(guī)則，可產(chǎn)生紅色色素.以菌株NH8的基因組DNA為模板，F(xiàn)27和R1492為引物，PCR擴增獲得約1.5 kb的16S rRNA基因片段.對擴增產(chǎn)物進行測序和序列比對分析，構(gòu)建了基于16S rRNA基因序列的菌株NH8及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系密切的典型菌株的系統(tǒng)進化樹，如圖1所示.

圖1 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic Tree Based on 16S rRNA Gene Sequence

由圖1可知，菌株NH8與Serratiamarcescensstrain B3R3聚在一支，兩者16S rRNA基因序列同源性為99.5%.結(jié)合形態(tài)特征，初步鑒定菌株NH8屬于粘質(zhì)沙雷氏菌屬(Serratiamarcescens)，將其命名為SerratiamarcescensNH8.

2.2 pqq基因簇引物的設(shè)計及全長pqq基因的擴增

從GenBank數(shù)據(jù)庫下載8株細菌pqq基因簇的pqqB，pqqC和pqqE片段序列，8株菌株分別為BurkholderiacepaciaATCC 25416 (NCBI登錄號CP012982.1)，AcinetobacteroleivoransDR1 (NCBI登錄號CP002080.1)，BurkholderiagladioliATCC 10248 (NCBI登錄號CP009322.1)，KlebsiellapneumoniaFDAARGOS_447 (NCBI登錄號CP023949.1)，MethylobacteriumextorquensAM1 (NCBI登錄號CP001510.1)，Serratiamarcescenssubsp.marcescensDb11(NCBI登錄號HG326223.1)，AcinetobacterpittiiPHEA (NC_016603.1)，PseudomonasaeruginosaPA83 (NCBI登錄號CP017293.1).通過CLUSTAL X軟件進行序列多重比對，根據(jù)比對結(jié)果設(shè)計了2對引物pqqB-F和pqqC-R，pqqC-F和pqqE-R(序列多重比對和引物設(shè)計見圖2).

A—pqqB;B—pqqC;C—pqqC;D—pqqE.圖2 pqq基因簇核苷酸序列多重比對Fig. 2 Multiple Alignments of Nucleotide Sequences Against pqq Genes Cluster

1—pqqB-F & pqqC-R；2—pqqC-F & pqqE-R；3—pqqA-F & pqqF-R；M—DNA Marker.圖3 3對引物的PCR擴增產(chǎn)物Fig. 3 PCR Products Based on Three Pairs of Primers

以SerratiamarcescensNH8基因組DNA為模板，利用引物pqqB-F和pqqC-R，pqqC-F和pqqE-R分別擴增得到約1 500 bp和1 200 bp的2條條帶(圖3泳道1，2)，將目的條帶切膠回收，純化后雙向測序，獲得pqqB，pqqE基因部分核苷酸序列信息和pqqC，pqqD基因全部序列信息.接著，將所測序的核苷酸序列拼接，送GenBank數(shù)據(jù)庫用BLAST分析.結(jié)果表明，擴增獲得的SerratiamarcescensNH8的pqq基因簇片段序列與Serratiamarcescensstrain B3R3(登錄號CP013046)的pqq基因簇同源性達到99%.因此，筆者參照Serratiamarcescensstrain B3R3的pqq基因簇全序列設(shè)計了引物pqqA-F和pqqF-R(表1)，利用這對引物成功擴增出SerratiamarcescensNH8的pqq全長基因片段，其長度約為5.5 kb(圖3泳道3).目的條帶經(jīng)純化后進行T克隆和測序，得到SerratiamarcescensNH8的pqq基因簇全部核苷酸序列.BLAST比對分析表明，SerratiamarcescensNH8的pqq基因簇全長序列與SerratiamarcescensWW4(登錄號CP003959)的pqq基因簇序列同源性高達99%，與Serratiamarcescensstrain B3R3(登錄號CP013046)，Serratiamarcescensstrain U36365(登錄號CP016032)和Serratiasp. FS14(登錄號CP005927)的pqq基因簇核苷酸序列同源性高達98%.

2.3 pqq基因簇結(jié)構(gòu)和生物信息學(xué)分析

SerratiamarcescensNH8的pqq基因簇結(jié)構(gòu)排布如圖4所示，包含6個開放閱讀框，分別為pqqA，pqqB，pqqC，pqqD，pqqE和pqqF.其中：基因pqqA與pqqB間隔58 bp，基因pqqB與pqqC間隔9 bp，基因pqqE與pqqF間隔2 bp；基因pqqC，pqqD和pqqE有部分核苷酸序列重疊現(xiàn)象，pqqC與pqqD重疊1 bp，pqqD與pqqE重疊8 bp.

SerratiamarcescensNH8的pqq基因簇序列全長5 535 bp，相對分子質(zhì)量約2.0×105，由1 819個氨基酸組成.其中：pqqA基因大小78 bp，編碼25個氨基酸，相對分子質(zhì)量2.8×103，PqqA短肽中保守的谷氨酸和酪氨酸是作為PQQ生物合成的骨架而起作用[12]；pqqB基因大小912 bp，編碼303個氨基酸，相對分子質(zhì)量3.3×104，PqqB可能涉及PQQ穿越質(zhì)膜進入細胞周質(zhì)的活動[13]；pqqC基因大小756 bp，編碼251個氨基酸，相對分子質(zhì)量2.8×104，PqqC是Pqq中最具有特征性的蛋白，通過催化8個電子參與的氧化反應(yīng)，使PQQ前體發(fā)生環(huán)化，從而生成PQQ[14]；pqqD基因大小279 bp，編碼92個氨基酸，相對分子質(zhì)量1.0×104；pqqE基因大小1 137 bp，編碼378個氨基酸，相對分子質(zhì)量4.2×104；pqqF基因大小2 313 bp，編碼770個氨基酸，相對分子質(zhì)量8.5×104.單個基因敲除實驗表明，pqq基因簇中4個基因的產(chǎn)物PqqA，PqqC，PqqD和PqqE是PQQ合成所必需的蛋白[7].核酸序列分析結(jié)果表明pqqB，pqqC，pqqD，pqqE和pqqF基因構(gòu)成細菌操縱子發(fā)揮作用.

圖4 Serratia Marcescens NH8的pqq基因簇結(jié)構(gòu)Fig. 4 Structure of pqq Genes Cluster from Serratia Marcescens NH8

3 結(jié)語

據(jù)文獻報道，PQQ 生物合成中涉及4～7個相關(guān)基因(pqq基因簇).如貪銅菌(Cupriavidustaiwanensissp.)的pqq基因簇包括pqqA，pqqB，pqqC，pqqD和pqqE[15]；菠蘿泛菌(Pantoeaananatissp.)和水生拉恩菌(Rahnellaaquatilissp.)的pqq基因簇包括pqqA，pqqB，pqqC，pqqD，pqqE和pqqF[16-17]；外鏈甲基桿菌(Methylobacteriumextorquenssp.)的pqq基因簇包括pqqA，pqqB，pqqC，pqqD，pqqE，pqqF和pqqG[14]等.筆者篩選的SerratiamarcescensNH8菌株也由pqqA，pqqB，pqqC，pqqD，pqqE和pqqF6個基因組成pqq基因簇.相似的結(jié)果表明，微生物合成PQQ的相關(guān)基因具有進化保守性.同時，多重比對發(fā)現(xiàn)微生物種屬之間參與PQQ生物合成的基因在數(shù)量和結(jié)構(gòu)上存在一些差異，表明生物合成PQQ的pqq基因簇具有遺傳多樣性.正因為如此，筆者采用分段克隆法，逐步獲得SerratiamarcescensNH8中pqq基因簇全長基因.

筆者通過富集培養(yǎng)分離了26株嗜甲基營養(yǎng)菌，HPLC檢測各菌發(fā)酵液發(fā)現(xiàn)僅產(chǎn)微量的PQQ或無法檢測到PQQ(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，表明這些菌株合成PQQ的產(chǎn)量極低.選取長勢優(yōu)良的菌株NH8，開展了基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，初步鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens).通過PCR引物設(shè)計，成功克隆出合成PQQ的pqq基因簇全長序列，并分析了其結(jié)構(gòu)和功能.工作的開展既為生物合成PQQ積累了微生物種質(zhì)資源，也為后續(xù)高效合成PQQ的重組工程菌構(gòu)建和PQQ代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的闡明提供了基因資源.

[1] KASAHARA T,KATO T.Nutritional Biochemistry:A New Redox-Cofactor Vitamin for Mammals[J].Nature,2003,422(6 934):832-836.

[2] KUMAZAWA T,SATO K,SENO H,et al.Levels of Pyrroloquinoline Quinone in Various Foods[J].Biochemistry,1995,307(2):331-333.

[3] STEINBERG F,STITES TE,ANDERSON P,et al.Pyrroloquinoline Quinone Improves Growth and Reproductive Performance in Mice Fed Chemically Defined Diets[J].Experimental Biology and Medicine,2003,228(2):160-166.

[4] KUMAZAWA T,SENO H,URAKAMI T,et al.Trace Levels of Pyrroloquinoline Quinone in Human and Rat Samples Detected by Gas Chromatography/Mass Spectrometry[J].Biochim Biophys Acta,1992,1 156(1):62-66.

[5] 唐 靚,張 嶺,李林子,等.吡咯喹啉醌研究新進展[J].食品科學(xué),2015,36(19):287-291.

[6] 孫靜嫻,杜 陽,張 鵬,等.吡咯喹啉醌生理醫(yī)學(xué)功效研究進展[J].生物學(xué)雜志,2012,29(6):80-83.

[7] SHEN Y Q,BONNOT F,IMSAND E M,et al.Distribution and Properties of the Genes Encoding the Biosynthesis of the Bacterial Cofactor,Pyrroloquinoline Quinone[J].Biochemistry,2012,51(11):2 265-2 275.

[8] VANKLEEF MA,DUINE J A.Factors Relevant in Bacterial Pyrroloquinoline Quinone Production[J].Applied and Environmental Microbiology,1989,55(5):1 209-1 213.

[9] JENKINS O,BYROM D,JONES D.Methylophilus:A New Genus of Methanol-Utilizing Bacteria[J].Int J Syst Bacteriol,1998,37:446-448.

[10] 徐 文,許 然,張利平.甲醇利用型吡咯喹啉醌產(chǎn)生菌的篩選與鑒定[J].生物技術(shù)通報,2013(1):162-165.

[11] 王 歆,汪建華,劉黨生,等.吡咯喹啉醌產(chǎn)生菌篩選方法建立及菌種篩選[J].微生物學(xué)報,2007,47(6):982-986.

[12] MEULENBERG J J M,SELLINK E,RIEGMAN NH,et al.Nucleotide Sequence and Structure of theKlebsiellaPneumoniaepqqOperon[J].Molecular Genetics and Genomics,1992,232(2):284-294.

[13] VELTEROP J S,SELLINK E,MEULENBERG J M,et al.Synthesis of Pyrroloquinolin QuinoneinVivoandinVitroand Detection of an Intermediate in the Biosynthetic Pathway[J].Bacteriology，1995,177(2):5 088-5 098.

[14] MAGNUSSON O T,TOYAMA H,SAEKI M,et al.Quinone Biogenesis:Structure and Mechanism of PqqC,the Final Catalyst in the Production of Pyrroloquinoline Quinone[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101:7 913-7 918.

[15] IRINA G,ANDREEVA L I,GOLUBEYA T M,et al.Identifcation of Pantoeaananatis Gene Encoding Membrane Pyrroloquinoline Quinone (PQQ)-Dependent Glucose Dehydrogenase andpqqABCDEFOperon Essential for PQQ Biosynthesis[J].FEMS Microbiology Letters,2011,318(1):55-60.

[16] GUO Y B,LI J,LI L,et al.Mutations That Disrupt Either thepqqor thegdhGene of Rahnellaaquatilis Abolish the Production of an Antibacterial Substance and Result in Reduced Biological Control of Grapevine Crown Gall[J].Applied and Environmental Microbiology,2009,75(21):6 792-6 803.

[17] TOYAMA H,CHISTOSERDOVA L,LIDSTROM M E.Sequence Analysis ofpqqGenes Required for Biosynthesis of Pyrroloquinoline Quinone inMethylobacteriumExtorquensAM1 and the Purification of a Biosynthetic Intermediate[J].Microbiology,1997,143(2):595-602.