姚 潔，蔡禮釗，劉湘寧，王亞玉，賴仁發(fā)

暨南大學(xué)1口腔醫(yī)學(xué)院,2生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院/生物醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510630

對于創(chuàng)傷、腫瘤和遺傳等因素導(dǎo)致的頜面部軟硬組織缺損及畸形的修復(fù)，一直是口腔醫(yī)學(xué)的臨床難題。近年來，隨著再生醫(yī)學(xué)、生物材料學(xué)科及計算機科學(xué)的飛速發(fā)展及融合，修復(fù)頜面部組織缺損的研究熱點已轉(zhuǎn)向仿生材料修復(fù)以及組織器官的再生修復(fù)。3D生物打印技術(shù)的發(fā)展正印證了這一學(xué)術(shù)潮流。以組織器官的再生修復(fù)為目標(biāo)的3D生物打印為頜面部組織的精細(xì)化修復(fù)帶來了新的思路和希望。本文圍繞著3D生物打印在口腔頜面部的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行簡單概述。3D打印的概念在1986年首次提出，3D打印的作用原理即將材料薄層打印出后再用紫外光固化，疊加在一起，得到三維立體模型[1]。3D生物打印則是引用3D打印的理念，利用生物材料或者活細(xì)胞逐層疊加構(gòu)造，形成一定的仿生形態(tài)或細(xì)胞微環(huán)境，即形成具有三維立體結(jié)構(gòu)的生物功能體[2]。

1 純生物材料生物打印（無生命的）

單純的生物材料打印不涉及細(xì)胞的打印，常見生物材料分為金屬和非金屬材料[3]（醫(yī)用高分子、生物陶瓷、生物衍生材料等）。常用的金屬材料包括純鈦和鈦合金、鎂及鎂合金，多用于牙種植以及頜面骨缺損的修復(fù)。Qassemyar等[4]在兩位分別因成釉細(xì)胞瘤和鱗狀細(xì)胞癌造成下頜骨缺損，需要進(jìn)行骨重建但無法從自身提取骨游離皮瓣的患者身上，利用3D生物打印定制了多孔鈦假體，從而代替骨游離皮瓣進(jìn)行修復(fù)。大多數(shù)金屬生物支架是不可降解的，不經(jīng)手術(shù)難以取出，往往給患者帶來二次傷痛以及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。這也使研究人員對生物可降解金屬的產(chǎn)生了濃厚興趣。Wang等[5]將AZ31型鎂合金設(shè)計成牽引裝置，在切除單側(cè)下頜骨的雜交犬身上進(jìn)行牽張成骨實驗。研究分別用AZ31鎂合金和不銹鋼作對照，結(jié)果顯示新型生物材料AZ31鎂合金對成骨的誘導(dǎo)結(jié)果與不銹鋼相似，在生物體內(nèi)可以降解，對肝、腎無毒性作用。研究人員還在研究如何控制生物材料的降解速率，如Hong等[6]通過3D打印精確控制生物可降解鐵錳合金中鈣的含量，發(fā)現(xiàn)鈣可以提高傳統(tǒng)的鐵錳合金的降解速率，相信在不遠(yuǎn)的將來，3D生物打印的可降解鐵錳-鈣合金在骨缺損修復(fù)確有可行之處。

非金屬材料常見的有生物陶瓷、醫(yī)用復(fù)合材料、生物衍生材料等[3, 7-9]；其中又以生物陶瓷最為常用，生物陶瓷是一類與人體骨組織成分相似，可以誘導(dǎo)骨的形成的材料[8]，常用的生物陶瓷成分主要有羥基磷灰石和磷酸三鈣。羥基磷灰石是骨和牙齒的主要成分，作為人工骨的早期替代材料，其生物相容性良好，但強度低、脆性大；磷酸三鈣作為人體硬組織修復(fù)材料則具有良好的生物相容性和降解能力[7]。將二者的特性結(jié)合起來，制作具有二者優(yōu)點的復(fù)合材料的研究從未間斷。研究人員利用3D打印技術(shù)制備由羥基磷灰石/β-磷酸三鈣（HA/β-TCP）組成的雙相磷酸鈣陶瓷（BCP）支架，研究其在骨組織工程中的應(yīng)用潛力，發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在此支架上黏附良好[10]。Ga?pari?等[11]將羥基磷灰石和納米纖維素結(jié)合，并進(jìn)行疏水化處理，研究其與人成骨細(xì)胞的相容性，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞在支架材料與膠原/磷灰石基質(zhì)上具有相似的生存能力。將含有銀離子的磷酸三鈣支架運用在頜面部缺損修復(fù)中，可持續(xù)性提供銀離子釋放，在一定程度上緩解術(shù)后感染的風(fēng)險[12]。

這些生物材料根據(jù)不同的要求，通過不同的3D打印技術(shù)，例如噴墨打印技術(shù)、選擇性激光燒結(jié)技術(shù)、光固化成型技術(shù)和熔融沉積技術(shù)等，在體外可以形成具有一定生物功能的生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品。

2 以活細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物打?。ㄓ猩模?/h2>

有研究2003年提出了“細(xì)胞打印”的概念，隨后形成了以活細(xì)胞為基礎(chǔ)的3D生物打印技術(shù)，即將活細(xì)胞和生物支架材料混合輸出并逐層疊加，形成具有三維立體結(jié)構(gòu)的有生命的生物功能體[1]。到目前為止能進(jìn)行3D打印的細(xì)胞種類繁多，已經(jīng)涉及到人體的組織的各類細(xì)胞，例如成骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞、人類纖維組織細(xì)胞和人脂肪干細(xì)胞等[13-16]。根據(jù)打印方式的不同細(xì)胞打印通常可以分為噴墨打印、激光直寫、聲控打印[15, 17-18]。以細(xì)胞打印為基礎(chǔ)的3D生物打印是最前沿的生命科學(xué)技術(shù)，以此為基礎(chǔ)的人工組織與器官構(gòu)建技術(shù)具有巨大的科學(xué)意義與應(yīng)用價值。

2.1 細(xì)胞打印的方式

2.1.1 噴墨打印 噴墨打印目前應(yīng)用廣泛，是最早應(yīng)用于細(xì)胞打印的技術(shù)之一，它是一種非接觸式的打印方式。噴墨打印的“生物墨水”是一種包含了活細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)以及其他生物物質(zhì)的一種共混物。最常見的噴墨產(chǎn)生方式是利用機器腔內(nèi)的熱應(yīng)力產(chǎn)生擠壓力，使噴頭噴出定量的墨水，或是利用壓電晶體在電壓作用下發(fā)生形變，產(chǎn)生壓力，將墨滴噴出噴嘴，精確控制液滴位置。噴墨打印雖然技術(shù)難度不高，分辨率好，然而也存在技術(shù)短板：若使用的“生物墨水”較為粘稠，不僅容易導(dǎo)致噴墨沉積不均勻，噴墨打印機的噴嘴很容易被堵住，這是研究人員需要克服的難關(guān)。

2.1.2 激光直寫 激光直寫，是利用激光束對細(xì)胞的作用力，使細(xì)胞發(fā)生移動，到達(dá)指定的位置。該打印系統(tǒng)主要由脈沖激光束源、聚焦系統(tǒng)、目標(biāo)板和接收板組成。3D生物打印激光直寫為防止激光對細(xì)胞直接作用，采用可吸收紫外光的目標(biāo)基板吸收激光束的能量。在其下方則放置一塊接收板。在打印過程中，利用激光聚焦于目標(biāo)板上，將細(xì)胞懸液打到接收板上面，從而完成打印。這種打印方式的分辨率高，精確度好，細(xì)胞與細(xì)胞之間不會發(fā)生污染，是完全沒有堵塞噴嘴風(fēng)險的打印方式。但同時，效率低下和激光造成細(xì)胞損傷、溶液蒸發(fā)的問題也困擾著研究者。

2.1.3 擠壓打印 擠壓打印可用于高粘度的生物墨水打印，通過機械螺栓或者氣動裝置擠壓液體腔，長絲從噴嘴里連續(xù)流出。印刷速度由氣動壓力以及機械螺栓的位移決定。此種打印方式準(zhǔn)確，連續(xù)且成本低。然而對壓力敏感的細(xì)胞打印成活率低的問題難以解決，高濃度的生物墨水依然容易造成噴嘴堵塞。

2.2 細(xì)胞打印的支架材料研究

以活細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物打印的組成材料為活細(xì)胞和生物支架材料，生物支架材料顯得格外重要，一方面要求與細(xì)胞有很好的相容性，具有良好生物降解功能，另一方面，需要一定的強度，供細(xì)胞粘附增殖。常用的支架材料有水凝膠、纖維蛋白原等。宋楊等[19]構(gòu)建了人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞-生物材料共混物三維打印體，獲得的細(xì)胞—海藻酸鈉一明膠共混物經(jīng)過體外培養(yǎng)一周，將其植人裸鼠背部皮下。結(jié)果顯示實驗組打印體中有類骨組織形成。Yang等[20]用海藻酸鈉（SA）混合的膠原型I（COL）或瓊脂糖，作為3D生物墨水，結(jié)合軟骨細(xì)胞構(gòu)建體外3D生物打印軟骨組織，結(jié)果顯示SA/COL可以明顯促進(jìn)細(xì)胞粘附，加速細(xì)胞增殖。Pati等[21]利用脫細(xì)胞的脂肪組織和人脂肪組織干細(xì)胞制作生物墨水，經(jīng)3D生物打印后體外培養(yǎng)后植入小鼠后背，該結(jié)構(gòu)沒有引起慢性炎癥反應(yīng)，反倒是促進(jìn)了局部組織重建和脂肪組織形成。有活細(xì)胞參與的3D生物打印，往往比單純的支架材料植入效果好，具有一定增殖、自我修復(fù)功能，可促進(jìn)局部組織愈合，提高組織重建能力，以期恢復(fù)組織結(jié)構(gòu)的生理功能。細(xì)胞打印是日后組織器官重建與移植的基礎(chǔ)。

3 以3D生物打印為基礎(chǔ)的組織器官構(gòu)建

目前可以經(jīng)過3D生物打印的器官組織有肝臟、腎臟、皮膚、血管等。研究表明，大多數(shù)體外肝臟組織模型只能模擬二維環(huán)境，在較短的時間就會喪失功能，Grix等[22]利用肝素和人星狀細(xì)胞結(jié)合，用3D生物打印的方式，組成一個復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，經(jīng)過兩周培養(yǎng)，各項生化檢測顯示正常。Kizawa等[23]利用無支架的3D生物打印技術(shù)構(gòu)建一小部分肝臟組織，可穩(wěn)定代謝藥物、葡萄糖和脂質(zhì)。Sochol等[24]討論了體外單層腎臟模型可利用3D打印技術(shù)，形成具有功能替代性的結(jié)構(gòu)。不少研究者著眼于皮膚這一身體中最大的一個器官，有學(xué)者研究了一種可引導(dǎo)皮膚再生的生物墨水混合細(xì)胞進(jìn)行皮膚組織打印，實驗證明3D生物打印的皮膚組織物理形態(tài)穩(wěn)定，沒有明顯萎縮[25]。單純打印血管組織并不困難，難點在于植入體內(nèi)后發(fā)揮運輸功能，Lee等[26]對3D生物打印血管網(wǎng)系統(tǒng)的生成進(jìn)行了研究，成功研制出一種3D打印的射血通道，可與附近的毛細(xì)血管網(wǎng)建立灌注血管通道。至此，可見3D生物打印技術(shù)取得了一定的發(fā)展。

然而，諸多3D生物打印的產(chǎn)物目前只是在體外實驗獲得成功，目前的組織器官尚不能用于人體，在人體內(nèi)行使功能。人體器官具有復(fù)雜性和多樣性，在人體內(nèi)部構(gòu)成一個有機整體，內(nèi)部環(huán)境需要血管網(wǎng)絡(luò)相交通，以傳遞營養(yǎng)。如今的3D打印技術(shù)能夠很好的實現(xiàn)細(xì)胞的空間位置排布，但實際上是缺少血管網(wǎng)這類有效通道結(jié)構(gòu)的。劉翀等[27]就利用現(xiàn)有的三維支架，利用計算機模擬，在其上建立模擬血管通路，以期得到包含血管通路網(wǎng)的三維支架。而Jia等[28]利用明膠、海藻酸鈉和4-arm聚乙二醇組成的生物墨水，與多層同軸擠壓系統(tǒng)結(jié)合使用，經(jīng)過細(xì)胞增殖，形成了具有生物組織性、可灌注的血管結(jié)構(gòu)。組織的血供完善是3D生物打印發(fā)展道路上亟待解決的問題，若能解決這個問題，頜面部修復(fù)中關(guān)于皮膚移植的難題也能迎刃而解[29]。

4 3D生物打印在口腔頜面部的應(yīng)用前景

目前3D打印在口腔頜面部應(yīng)用較為局限，主要是純生物材料的3D打印，例如鈦金屬經(jīng)3D打印成種植體精確性良好，有報道稱鈦合金根形種植體在臨床應(yīng)用中獲得成功[30]，有效地利用金屬或非金屬的生物材料打印為頜骨支架，如王寧等[31]就利用3D純生物材料打印技術(shù)，打印了鈦合金下頜骨，為因切除左下頜骨腫瘤造成骨缺損的患者進(jìn)行頜骨重建。Lee等[32]則利用納米羥基磷灰石/聚酰胺（n-ha/PA）作為支架材料修復(fù)了髁狀突缺損，恢復(fù)了面部外形。這類技術(shù)的運用為頜面部缺損修復(fù)提供便利，節(jié)省手術(shù)時間，提高了修復(fù)效果。頜面部骨組織外側(cè)有層層包裹的肌肉、皮膚，其中有錯綜復(fù)雜交疊的血管和神經(jīng)。對于以活細(xì)胞為基礎(chǔ)生物打印，涵蓋了軟骨及骨組織、皮膚、血管、神經(jīng)等組織的相關(guān)打印技術(shù)，同樣適用于口腔頜面部軟骨及骨組織、皮膚、血管、神經(jīng)等組織的重建。Li[33]發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)提取內(nèi)源性的祖細(xì)胞（ACPCs）可經(jīng)3D生物打印用于顳下頜關(guān)節(jié)盤損傷修復(fù)。

綜上所述，3D生物打印是純生物材料的打印，同時包含了以活細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物打印。3D細(xì)胞打印可通過噴墨打印、激光直寫、擠壓打印等方式在細(xì)胞多樣性的選擇及三維構(gòu)筑結(jié)構(gòu)的精確性上有很大進(jìn)步，但仍需克服諸如復(fù)雜結(jié)構(gòu)的多細(xì)胞打印、直徑大液滴打印等問題。如今已有體外構(gòu)建有功能的人體組織器官的報道，隨著新型生物材料的更新和細(xì)胞支架材料制造技術(shù)的發(fā)展，相信隨著科技的不斷發(fā)展，以組織器官的再生修復(fù)為目標(biāo)的3D生物打印為頜面部組織的精細(xì)化修復(fù)是口腔頜面部組織修復(fù)的必然發(fā)展方向，有著廣闊的科學(xué)研究和臨床應(yīng)用前景。