張 瑜，王 文，米成嶸

寧夏醫(yī)科大學(xué)1臨床醫(yī)學(xué)院,2總醫(yī)院心腦血管病醫(yī)院超聲科,3總醫(yī)院超聲科，寧夏 銀川 750000

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2011年乳腺癌占全球女性新發(fā)癌癥的26%左右，占女性癌癥死亡人口的14%左右[1]。醫(yī)學(xué)影像技術(shù)的發(fā)展實(shí)現(xiàn)了臨床診斷早期乳腺癌的可能性，其中，無(wú)論是鉬靶還是超聲都很容易探及的一個(gè)乳腺惡性征象便是乳腺微鈣化（MC）。美國(guó)放射協(xié)會(huì)乳腺影像報(bào)告和數(shù)據(jù)系統(tǒng)（BI-RADS）將MC定義為超聲或X線鉬靶攝影上直徑小于1 mm的鈣化，后方通常不伴有聲影。而首次提出乳腺癌MC概念的是在1913年對(duì)離體乳腺標(biāo)本進(jìn)行X線檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)了這一征象[2]。1951年，放射學(xué)家Nalawade[3]首次提出，MC或許是乳腺惡性腫瘤的唯一征象。從此以后，大批研究人員致力于乳腺M(fèi)C的研究，為乳腺惡性腫瘤的診斷及預(yù)后評(píng)估提供了大量的證據(jù)。而對(duì)于MC的形成機(jī)制人們卻了解甚少，本文將對(duì)乳腺癌MC形成的分子機(jī)制做一較全面的總結(jié)。

1 乳腺癌MC的化學(xué)成分

在乳腺組織中常見兩種類型的MC物質(zhì)。I型是雙水草酸鈣（CaC2O4·2H2O），HE染色不著色，光鏡下表現(xiàn)為琥珀色，并具有強(qiáng)屈光率，常規(guī)組織學(xué)檢查很難觀察到，只有運(yùn)用偏光顯微鏡才能捕捉到。II型是羥基磷灰石[HA，Ca10（PO4）·6H2O]，光鏡下表現(xiàn)為灰白色，HE染色為堿性藍(lán)染。一些研究認(rèn)為MC生化成分的構(gòu)成與疾病狀態(tài)有關(guān)。在Scimeca等[4]的研究中，使用能量彌散型X線分析儀對(duì)66例MC穿刺標(biāo)本進(jìn)行了超微結(jié)構(gòu)分析，從而第1次證實(shí)，羥磷灰石主要存在于乳腺惡性病變中，而草酸鈣主要存在于良性病變中。而在Haka等[5]的研究中，I型鈣化被認(rèn)為幾乎只在乳腺囊腫內(nèi)出現(xiàn)，很少發(fā)生于癌，而II型MC物質(zhì)通常出現(xiàn)在增生性病變中，包括良性和惡性疾病。良性增生性病變內(nèi)的鈣化同時(shí)含有較高水平碳酸鹽，而惡性病變內(nèi)只含有較純的羥磷灰石鈣成分[6]。Baker[7]應(yīng)用紅外顯微鏡對(duì)來(lái)自于110例患者的236個(gè)MC樣本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，MC的生化成分與病變的等級(jí)具有顯著相關(guān)性，在乳腺良性病變組、導(dǎo)管原位癌組及浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組中，MC內(nèi)碳酸鹽含量逐級(jí)減少，而蛋白含量逐級(jí)增多，在導(dǎo)管原位癌中，隨著組織學(xué)級(jí)別的升高，也可出現(xiàn)類似趨勢(shì)。Liang等[8]應(yīng)用拉曼光譜對(duì)乳腺纖維腺瘤、乳腺癌前病變及乳腺原位癌內(nèi)的鈣化成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)乳腺病變惡性程度越高，蛋白質(zhì)、氨基酸殘基、類胡蘿卜素和核苷酸等鈣化成分越多。

2 HA與乳腺癌的關(guān)系

Morgan等[9]對(duì)MCF-7和Hs578T乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行的體外研究實(shí)驗(yàn)首次從分子水平揭示了HA與乳腺癌的關(guān)系，HA具有誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞有絲分裂的潛力。Cox等[10]的一項(xiàng)最新研究顯示，乳腺癌細(xì)胞系Hs578T的浸潤(rùn)性亞克隆細(xì)胞群其鈣化能力（HA水平）高于其母代細(xì)胞及正常乳腺上皮細(xì)胞，而乳腺肺轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞4 T1鈣化的發(fā)生也早于浸潤(rùn)性乳腺癌細(xì)胞系Hs578T亞克隆群。這些研究結(jié)果表明MC可以作為乳腺惡性腫瘤強(qiáng)有力的預(yù)測(cè)因子，且對(duì)乳腺癌惡性程度的評(píng)估具有一定參考價(jià)值。

3 基質(zhì)小泡在乳腺癌MC形成中的作用

基質(zhì)小泡（MVs）的合成是乳腺癌MC形成過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。MVs是一類小的（20～200 nm）膜狀脂質(zhì)封閉結(jié)構(gòu)，存在于具有成骨功能的細(xì)胞中，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等，對(duì)于MVs的發(fā)生機(jī)制有各種假說(shuō)。其中最廣泛被采納的觀點(diǎn)是MVs在鈣化形成過(guò)程中通過(guò)出芽的方式從細(xì)胞膜特定部位脫離出來(lái)[11]。許多研究表明，乳腺腫瘤細(xì)胞也產(chǎn)生MVs[12]。MVs脂質(zhì)膜成分與其來(lái)源的細(xì)胞膜成分顯著不同。MVs的脂質(zhì)膜富含組織非特異性堿性磷酸酶（TNAP）、磷脂酰絲氨酸（PS）、膜聯(lián)蛋白、NaPi轉(zhuǎn)運(yùn)體、核苷酸焦磷酸酶磷酸二酯酶1（NPP1 PC1）及磷酸酶（PE/PC磷酸酶），這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)能夠?yàn)镸Vs轉(zhuǎn)運(yùn)Ca2+和PO43+，促進(jìn)HA單晶的形成。這些MVs將新合成的HA單晶從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，在細(xì)胞外液中形成成熟的HA結(jié)晶鈣[13-15]。而HA單晶如何轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腍A結(jié)晶鈣還是未知的。

MVs在正常生理性鈣化和異位病理性鈣化過(guò)程中均可出現(xiàn)。利用透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)在小鼠動(dòng)脈粥樣硬化和人類纖維帽中均存在MVs[16]。此外，最近New等[17]發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細(xì)胞也能夠合成和分泌MVs，加速了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中鈣化的形成。這些發(fā)現(xiàn)均表明，MVs在不同的組織器官的的病理生理礦化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

4 乳腺癌MC的發(fā)生與MVs的關(guān)系

如上文所述，乳腺腫瘤細(xì)胞也能夠產(chǎn)生MVs。但尚沒(méi)有報(bào)道解釋乳腺癌細(xì)胞MVs的具體組成成分或者乳腺腫瘤細(xì)胞MVs的脂質(zhì)膜成分是否與成骨類細(xì)胞的MVs成分相同。最近研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤細(xì)胞分泌的MVs與成骨細(xì)胞MVs的成分相同[18]。據(jù)報(bào)道，乳腺癌細(xì)胞膜中的MVs成分較對(duì)照組正常乳腺上皮細(xì)胞顯著增高，如瞬時(shí)感受電位（TRP）陽(yáng)離子通道、膜聯(lián)蛋白A2、A4及A5等[19]，富含這類蛋白結(jié)構(gòu)的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)域脫離胞體形成MVs，為乳腺癌MC的形成提供大量Ca2+。類似研究還發(fā)現(xiàn)與正常乳腺上皮細(xì)胞相比，乳腺癌4 T1細(xì)胞通過(guò)NaPi-IIb（SLC34A2）協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的高表達(dá)積累大量PO43+，且經(jīng)過(guò)Na-Pi轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑膦酸處理后，鈣化過(guò)程即會(huì)終止[20]。

轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞/組織與非轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞/組織相比，MVs的許多成分（如TRP陽(yáng)離子通道，膜聯(lián)蛋白等）表達(dá)均有所升高；浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌與非浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌相比，Ca2 +通道（TRPM7和TRPC1）的表達(dá)水平也較高[21]。更有證據(jù)直接顯示乳腺癌細(xì)胞中TRP陽(yáng)離子通道7表達(dá)水平的升高能夠延長(zhǎng)乳腺癌細(xì)胞壽命，促進(jìn)細(xì)胞增殖，遷移和轉(zhuǎn)移[22]。

綜上所述，與其他組織器官相同，乳腺腫瘤組織的MC也是在MVs中生成。且大量研究結(jié)果均支持轉(zhuǎn)移/浸潤(rùn)性乳腺癌細(xì)胞與非轉(zhuǎn)移/浸潤(rùn)性乳腺癌細(xì)胞相比，MVs含量更高，具有更強(qiáng)的形成病理性鈣化的能力。MVs的成分能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

5 乳腺癌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變

無(wú)論任何組織細(xì)胞發(fā)生病理性鈣化時(shí)都會(huì)首先轉(zhuǎn)變成骨樣細(xì)胞，表達(dá)上述骨轉(zhuǎn)錄因子、ALP及骨基質(zhì)蛋白以模擬生理性鈣化過(guò)程的方式產(chǎn)生病理性鈣化。例如在動(dòng)脈粥樣硬化疾病中部分血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)變成成骨樣細(xì)胞產(chǎn)生鈣化沉積于動(dòng)脈管壁[23]。同樣，乳腺腫瘤組織中MC的形成與腫瘤細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。許多文獻(xiàn)報(bào)道自乳腺癌患者腫瘤組織中能夠分離出成骨樣細(xì)胞及成軟骨樣細(xì)胞成分，這類細(xì)胞高度表達(dá)ALP、OPN等成骨相關(guān)蛋白[24]。在LCC15-MB和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系中均能夠發(fā)現(xiàn)正常乳腺上皮細(xì)胞中不存在的Runx2活性[25]。在MCF-7、T47-D、SKBR3和ZR75-1乳腺癌細(xì)胞系中，Msx2的表達(dá)水平均較正常乳腺上皮細(xì)胞高[26]。MCF-7乳腺癌細(xì)胞系經(jīng)分化誘導(dǎo)劑17β-雌二醇處理后表達(dá)ALP[27]。Cox等[20]的最新研究結(jié)果顯示經(jīng)成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑處理轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系4 T1和正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF10A后，前者高表達(dá)ALP，而后者不表達(dá)，且4 T1細(xì)胞經(jīng)ALP抑制劑左旋咪唑處理后鈣化過(guò)程即減緩。這些數(shù)據(jù)均表明，在特定微環(huán)境下部分乳腺癌上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒菢蛹?xì)胞參與乳腺癌MC的形成。

另外，還有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)比乳腺癌組患者與對(duì)照組患者，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組患者與無(wú)骨轉(zhuǎn)移組患者，晚期乳腺癌組患者與早期乳腺癌組患者或健康對(duì)照組人群，前者血漿ALP水平更高[28-29]。還有文獻(xiàn)報(bào)道浸潤(rùn)性癌OPN及BSP的表達(dá)水平高于非浸潤(rùn)性癌[30]。乳腺癌患者血漿中ALP、OCN及BSP水平均較乳腺良性腫瘤患者的血漿水平高[20]。這類證據(jù)也提示乳腺癌惡性程度越高其鈣化能力越強(qiáng)，進(jìn)一步為MC評(píng)估乳腺癌惡性程度提供了依據(jù)。

6 乳腺癌細(xì)胞通過(guò)上皮間質(zhì)化進(jìn)程獲得成骨細(xì)胞特征

乳腺癌組織中部分異質(zhì)性細(xì)胞亞群發(fā)生上皮間質(zhì)化（EMT）從而獲得了更高的侵襲性及轉(zhuǎn)移能力。浸潤(rùn)性乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞顯示其表達(dá)的骨轉(zhuǎn)錄因子Runx-2水平高于非浸潤(rùn)性乳腺癌細(xì)胞MCF-7，而前者在性能上更趨于間質(zhì)化[31]。同樣，MDAMB231細(xì)胞Runx-2DNA結(jié)合活性也高于乳腺正常上皮細(xì)胞[32]。Hassan等[33]的研究顯示小RNAmiR-218通過(guò)增強(qiáng)Runx-2的表達(dá)能夠提高癌細(xì)胞的間質(zhì)性并促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移能力，證實(shí)了Runx-2表達(dá)水平與癌細(xì)胞的間質(zhì)性及轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。異位表達(dá)的Runx-2能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化[25]。因此，Runx-2的表達(dá)能夠增加乳腺癌細(xì)胞的侵襲性能并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

另外一個(gè)骨轉(zhuǎn)錄因子Msx-2同樣也作為腫瘤細(xì)胞間質(zhì)化及侵襲力的誘導(dǎo)因子在腫瘤組織中高表達(dá)，Msx-2的過(guò)表達(dá)還能夠抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，表明Msx-2的促間質(zhì)化功能或許是通過(guò)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。更重要的是，Msx-2的表達(dá)水平還可提示腫瘤的惡性程度，隨著腫瘤自良性向惡性過(guò)渡，其表達(dá)水平不斷提高。與Runx-2相同，Msx-2也能夠促進(jìn)間質(zhì)化細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化[34]。

成骨細(xì)胞是由間充質(zhì)細(xì)胞分化而來(lái)，與此類似，上述研究結(jié)果證實(shí)在乳腺癌進(jìn)展過(guò)程中，部分表皮樣細(xì)胞在骨轉(zhuǎn)錄因子的驅(qū)動(dòng)下通過(guò)間質(zhì)化進(jìn)程獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型，其中部分間充質(zhì)細(xì)胞同樣在骨轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)下再轉(zhuǎn)化成成骨樣細(xì)胞。另一研究結(jié)果也支持這一觀點(diǎn)，該研究發(fā)現(xiàn)在含微鈣化的浸潤(rùn)性癌組織中間充質(zhì)細(xì)胞表面分子（如波形蛋白、β-連環(huán)蛋白等）及成骨相關(guān)蛋白（如OPN、OCN等）均高于無(wú)微鈣化浸潤(rùn)性癌組織[4]。

7 骨形成蛋白在乳腺癌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用

越來(lái)越多的證據(jù)顯示骨形成蛋白-2（BMP-2）在乳腺癌MC的形成過(guò)程中起關(guān)鍵作用。BMPs（除BMP-1外）屬于多功能生長(zhǎng)因子—轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGFs）家族。早期研究發(fā)現(xiàn)，BMPs是有效的骨形成誘導(dǎo)劑，作用于軟骨、骨及動(dòng)脈管壁等不同組織的生理及病理性鈣化[35]。

Sando等[24]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)BMP-2處理過(guò)的4 T1轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞鈣化能力增強(qiáng)。另一個(gè)研究小組觀察發(fā)現(xiàn)將過(guò)表達(dá)BMP-2的R3230大鼠乳腺癌細(xì)胞接種到脂肪墊，大鼠將長(zhǎng)出含微鈣化的乳腺癌瘤體，而普通的R3230細(xì)胞并無(wú)此功能。該小組同時(shí)發(fā)現(xiàn)經(jīng)重組BMP-2處理過(guò)的荷瘤大鼠，其所有癌組織內(nèi)均生成微鈣化[36]。所有這些證據(jù)顯示BMP-2能夠誘導(dǎo)鈣化性乳腺癌的生成。 Liang等[8]的研究結(jié)果表明相比于不含微鈣化的浸潤(rùn)性乳腺癌，含微鈣化的浸潤(rùn)性乳腺癌BMP-2水平上調(diào)，并且高度表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞表面分子及成骨相關(guān)蛋白。更有證據(jù)直接顯示BMP能夠增加TRP陽(yáng)離子通道的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MVs對(duì)Ca2+的攝取及MC的形成[37]。Bragdon等[38-39]對(duì)BMP的信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)非經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)途徑，BMP主要執(zhí)行延長(zhǎng)細(xì)胞壽命、促進(jìn)有絲分裂、誘導(dǎo)EMT的功能，而通過(guò)經(jīng)典Smad信號(hào)傳導(dǎo)途徑，BMP主要執(zhí)行促進(jìn)骨轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和EMT細(xì)胞鈣化的功能。許多研究還發(fā)現(xiàn)BMPs在特定環(huán)境下還可抑制癌細(xì)胞增殖，但同時(shí)也能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)[40]，這一特點(diǎn)可能是基于BMP的促上皮間質(zhì)化功能。另外，最近還有文獻(xiàn)報(bào)道血漿BMP水平與乳腺癌轉(zhuǎn)移及晚期乳腺癌具有相關(guān)性[41]。

8 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞加速微鈣化的形成

乳腺癌腫瘤組織成分包括腫瘤細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞以及非腫瘤細(xì)胞，其中非腫瘤細(xì)胞主要包括腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）。乳腺癌腫瘤細(xì)胞能夠分泌多種炎癥介質(zhì)，如CCL2、CCL5、CSF-1等，招募巨噬細(xì)胞至腫瘤組織處，這類由腫瘤組織的趨化作用集聚的巨噬細(xì)胞稱為TAMs，該過(guò)程進(jìn)一步加劇了腫瘤的惡性程度。據(jù)報(bào)道，轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞比非轉(zhuǎn)移性細(xì)胞分泌更多的CSF-1[42]。血漿CSF-1的濃度與多種腫瘤的惡性程度相關(guān)，如子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌以及卵巢癌[43]。這類巨噬細(xì)胞在乳腺癌MC的形成中也起了關(guān)鍵作用，它們能夠產(chǎn)生MVs從而為MC的形成提供大量HA單晶[44]。在另外一些研究中對(duì)乳腺癌組織進(jìn)行活檢發(fā)現(xiàn)MC周圍存在大量巨噬細(xì)胞[45]，這一結(jié)果也驗(yàn)證了上述觀點(diǎn)。因此可以得出結(jié)論，TAMs在乳腺癌MC的形成中也起了一定的作用。

9 微鈣化的形成機(jī)制

基于上述所有觀點(diǎn)，為乳腺癌微鈣化的形成機(jī)制做一總結(jié)：在特定微環(huán)境下，部分異質(zhì)性乳腺癌上皮細(xì)胞在BMP和骨轉(zhuǎn)錄因子的作用下發(fā)生EMT繼而獲得成骨細(xì)胞特征，這類成骨樣細(xì)胞在特定程序下高度表達(dá)NaPi-IIb轉(zhuǎn)運(yùn)體、NPP、TNAP、TRPC及陽(yáng)離子通道等膜蛋白，此后富含這類蛋白分子的脂質(zhì)膜微結(jié)構(gòu)域從細(xì)胞膜脫離出來(lái)形成細(xì)胞內(nèi)的MVs結(jié)構(gòu)，MVs攝取大量Ca2+和PO43+，并將它們轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外基質(zhì)形成HA單晶。最后HA單晶與骨基質(zhì)蛋白沉淀為成熟HA結(jié)晶鈣，而HA單晶轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒霩A結(jié)晶鈣的機(jī)制尚未闡明。另外BMPs能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，這些凋亡小體也能夠誘導(dǎo)MC的生成。同時(shí)BMPs能夠抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，阻礙腫瘤生長(zhǎng)，該過(guò)程往往同時(shí)伴隨腫瘤上皮細(xì)胞的EMT。此外，炎癥介質(zhì)如CSF-1、CCL2、CCL5等的產(chǎn)生趨化大量腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞生成MVs，為MC的形成提供HA單晶核心。

10 展望

大量基礎(chǔ)及影像學(xué)研究致力于探討乳腺癌MC對(duì)乳腺癌預(yù)后的診斷價(jià)值，已經(jīng)有部分文獻(xiàn)指出乳腺癌MC可以做為乳腺癌惡性程度的預(yù)測(cè)因素，然而還需要更多的研究結(jié)論來(lái)佐證。已知在BMPs及骨轉(zhuǎn)錄因子的驅(qū)動(dòng)作用下乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT獲得成骨功能從而啟動(dòng)MC形成過(guò)程，但其具體的分子機(jī)制還有待闡述。ALP、OPN、BMPs等骨形成相關(guān)蛋白將來(lái)可能作為乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中血清學(xué)的一個(gè)潛在生物學(xué)標(biāo)志來(lái)評(píng)估乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)。未來(lái)的研究還將關(guān)注于靶向作用于微鈣化的新型乳腺癌治療手段，乳腺癌通常發(fā)生于絕經(jīng)后女性，女性通常在這個(gè)年齡將增加罹患骨質(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn)，因此，這類治療藥物必須同時(shí)滿足靶向作用于乳腺癌MC且不使全身骨量受損。