王啟源，徐紅艷，姬文蘭

(陜西省結(jié)核病防治院內(nèi)四科，陜西 西安 710100)

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)是引起結(jié)核病(tuberculosis)的一種傳染性病原菌[1]。肺泡巨噬細(xì)胞是結(jié)核分枝桿菌感染的主要靶細(xì)胞，在結(jié)核分枝桿菌感染的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮關(guān)鍵作用。巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)是宿主防御結(jié)核分枝桿菌的第一道防線[2]。宿主的免疫反應(yīng)對(duì)結(jié)核感染的進(jìn)展至關(guān)重要，了解結(jié)核分枝桿菌與宿主之間的相互作用對(duì)于控制結(jié)核是至關(guān)重要的。巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的大量細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)參與宿主防御結(jié)核分枝桿菌機(jī)制。

富亮氨酸重復(fù)序列激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)是由PARK8基因編碼的一種蛋白激酶。關(guān)于LRRK2的研究主要集中于慢性腸炎、麻風(fēng)病和家族性帕金森病等。LRRK2在免疫調(diào)節(jié)中的作用主要依賴于特定的細(xì)胞類型及刺激環(huán)境。有研究表明LRRK2在小鼠神經(jīng)炎癥的動(dòng)物模型中高表達(dá)，且能夠調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥應(yīng)答[3]。干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中LRRK2的產(chǎn)生，此外，LRRK2對(duì)于巨噬細(xì)胞中細(xì)菌生存是非常必要的[4]。LRRK2通過(guò)負(fù)調(diào)控活化T細(xì)胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells 1，NFAT1)抑制巨噬細(xì)胞中炎癥因子的產(chǎn)生[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)LRRK2通過(guò)激活核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生[6]。而且，LRRK2通過(guò)促進(jìn)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答進(jìn)程[4]。

基于以上研究背景，本研究采用卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)菌株感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞RAW264.7為細(xì)胞模型，建立了穩(wěn)定的結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞模型，通過(guò)探討LRRK2對(duì)BCG感染后誘發(fā)巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)及細(xì)菌生存率的調(diào)節(jié)作用，以期闡明LRRK2/NF-κB信號(hào)對(duì)巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌感染的免疫調(diào)控機(jī)制，從而為進(jìn)一步研究結(jié)核分枝桿菌在機(jī)體內(nèi)的免疫機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

材　料　和　方　法

1　材料和試劑

小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7(中科院上海細(xì)胞所)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(HyClone)；TRIzol試劑盒(Invitrogen)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)；SYBR Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific)；抗LRRK2、p-p65和GAPDH蛋白抗體(Cell Signaling Technology)；ECL顯影試劑盒(Millipore)；IL-1β、IL-6和IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(R&D)；NF-κB抑制劑PDTC(Sigma)。

2　方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)將RAW264.7細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d傳代1次。

2.2BCG感染巨噬細(xì)胞模型的建立RAW264.7細(xì)胞復(fù)蘇后傳2～3代，待細(xì)胞穩(wěn)定后細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%，按照感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI；即細(xì)菌數(shù)∶細(xì)胞數(shù))為10∶1加入BCG菌懸液，輕輕搖勻，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃、5% CO2孵育。感染4 h后更換新鮮培養(yǎng)基，24 h后收集細(xì)胞。

2.3qPCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平細(xì)胞總RNA提取按照TRIzol試劑盒說(shuō)明書操作，將細(xì)胞總RAN逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。應(yīng)用SYBR Green熒光染料試劑盒進(jìn)行qPCR。采用Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定各相應(yīng)條帶的灰度值，選取GAPDH作為內(nèi)參照。通過(guò)Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，目的基因的相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。引物序列見表1。

表1　qPCR引物序列Table 1.The primer sequences for qPCR

2.4Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液作用1 min，13 000 r/min離心15 min，吸取上清即細(xì)胞總蛋白，置于-80 ℃凍存?zhèn)溆?。用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度后，蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜。經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入相應(yīng) I 抗4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的相應(yīng) II 抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光，顯影，定影，拍照；Western blot檢測(cè)條帶用凝膠成像儀分析系統(tǒng)Quantity One軟件掃描灰度值。計(jì)算目的蛋白與GAPDH灰度值的比值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.5菌落形成單位(colony-forming unit,CFU)計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌生存率巨噬細(xì)胞感染結(jié)核菌4 h后，用不含血清的DMEM培養(yǎng)液洗滌2次以除去細(xì)胞間未被巨噬細(xì)胞吞噬的細(xì)菌。向細(xì)胞培養(yǎng)板中再加入完全DMEM培養(yǎng)液1 mL繼續(xù)培養(yǎng)。分別于細(xì)菌感染后的24 h和48 h去除12孔細(xì)胞板中的培養(yǎng)液，每孔加入500 μL 0.5% Triton X-100裂解細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察巨噬細(xì)胞的裂解情況，待巨噬細(xì)胞全部裂解后每孔加入500 μL完全培養(yǎng)液終止裂解。振蕩混勻5 min，接種于7H11培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3周后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

2.6ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清細(xì)胞因子的水平分別收集感染24 h后的培養(yǎng)上清，采用ELISA法測(cè)定促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和IFN-γ的水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行分析，應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件作圖。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中LRRK2的表達(dá)水平

為闡明LRRK2在BCG感染的巨噬細(xì)胞中的作用，首先采用qPCR及Western blot檢測(cè)BCG感染的RAW264.7細(xì)胞中LRRK2的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)BCG感染后，LRRK2的mRNA及蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，感染6 h后LRRK2的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，至24 h時(shí)到達(dá)頂峰，48 h有所下降，由此表明，BCG刺激可以誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)LRRK2的表達(dá)水平，見圖1。

Figure 1.The expression of LRRK2 at mRNA and protein levels in RAW264.7 cells infected with BCG.A:qPCR was used to detect the mRNA expression of LRRK2; B:Western blot was performed to determine the protein expression of LRRK2.Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 h group.
圖1BCG對(duì)RAW264.7細(xì)胞中LRRK2的表達(dá)的影響

2　LRRK2對(duì)BCG感染的結(jié)核分枝桿菌存活率的影響

將小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA，si)-陰性對(duì)照(negative control，NC)和si-LRRK2分別轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后，用BCG感染，qPCR和Western blot結(jié)果表明沉默LRRK2后細(xì)胞中LRRK2的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖2A、B。CFU計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)BCG處理后胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌存活率明顯升高，而si-LRRK2組的細(xì)菌生存率顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明LRRK2沉默能夠抑制BCG誘導(dǎo)的結(jié)核分枝桿菌的存活率，見圖2C。

3　LRRK2對(duì)BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答的影響

ELISA檢測(cè)LRRK2對(duì)BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中炎癥因子分泌的影響，結(jié)果顯示，BCG刺激誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞后，IL-1β、IL-6和IFN-γ的水平顯著上調(diào)，而LRRK2下調(diào)明顯降低BCG誘導(dǎo)的上述促炎細(xì)胞因子的水平(P<0.05)，見圖3A～C。進(jìn)一步采用qPCR驗(yàn)證，結(jié)果與ELISA一致，沉默LRRK2降低BCG刺激分泌的細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)，見圖3D～F。以上結(jié)果表明LRRK2沉默能夠抑制BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答進(jìn)程。

4　LRRK2通過(guò)正調(diào)控NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答進(jìn)程

為了探討LRRK2對(duì)BCG誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制，檢測(cè)了LRRK2對(duì)NF-κB通路的影響，qPCR和Western blot結(jié)果所示，BCG感染明顯激活NF-κB通路，而下調(diào)LRRK2通過(guò)顯著降低p-p65的蛋白水平抑制NF-κB信號(hào)通路(P<0.05)。同時(shí)，采用NF-κB通路的抑制劑PDTC探討NF-κB信號(hào)是否參與LRRK2調(diào)控炎癥應(yīng)答，結(jié)果顯示PDTC顯著抑制BCG刺激誘導(dǎo)的炎癥因子IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)(P<0.05)，類似于LRRK2沉默的作用效果。由此說(shuō)明下調(diào)LRRK2可能通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路抑制BCG感染的炎癥應(yīng)答進(jìn)程，見圖4。

Figure 2.The effect of LRRK2 on the viability ofMycobacteriumtuberculosisin the RAW264.7 cells.A and B:qPCR and Western blot were used to evaluate the efficiency ofLRRK2 knockdown in the RAW264.7 cells； C:mycobacterial viability was measured by CFU assay.Mean±SD.n=5.*P<0.05vssi-NC group.
圖2LRRK2對(duì)BCG感染的RAW264.7中細(xì)菌生存率的影響

Figure 3.The effect of LRRK2 on the releases of inflammatory factors induced by BCG infection in the RAW264.7 cells.A,B and C:the release levels of IL-1β,IL-6 and IFN-γ from the RAW264.7 cells were examined by ELISA； D,E and F:the mRNA expression of IL-1β,IL-6 and IFN-γ was detected by qPCR.Mean±SD.n=5.*P<0.05vsuntreated group;#P<0.05vssi-NC group.
圖3LRRK2對(duì)BCG誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中炎癥因子分泌水平的影響

討　　論

結(jié)核分枝桿菌是典型的胞內(nèi)致病菌，肺泡巨噬細(xì)胞是結(jié)核分枝桿菌感染的主要靶細(xì)胞和宿主細(xì)胞，能夠?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌在宿主體內(nèi)感染提供關(guān)鍵的胞內(nèi)生存環(huán)境。結(jié)核分枝桿菌通過(guò)巨噬細(xì)胞表面的受體介導(dǎo)作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)[7]。

研究報(bào)道LRRK2能夠調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[4,8-9]。為檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染是否會(huì)導(dǎo)致LRRK2表達(dá)水平發(fā)生變化，建立了結(jié)核分枝桿菌BCG感染巨噬細(xì)胞RAW264.7的體外模型，觀察了結(jié)核分枝桿菌感染細(xì)胞6、12、24及48 h時(shí)LRRK2的變化情況。qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)均顯示，BCG感染RAW264.7細(xì)胞中LRRK2的表達(dá)水平明顯上調(diào)，并且與感染時(shí)間有關(guān)。該結(jié)果表明LRRK2在巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌感染中具有重要作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)沉默LRRK2抑制BCG感染RAW264.7細(xì)胞的結(jié)核分枝桿菌存活率。

Figure 4.NF-κB signaling was involved in the process of LRRK2-medicated inflammatory responses.A:Western blot was performed to determine the protein levels of p-p65 and p65; B:the mRNA expression of IL-1β and IL-6 was examined by qPCR.Mean±SD.n=5.*P<0.05vsuntreated group;#P<0.05vssi-NC group；&P<0.05vscontrol group.
圖4NF-κB信號(hào)通路參與LRRK2調(diào)節(jié)BCG誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)答過(guò)程

結(jié)核桿菌感染，特別是在感染早期，炎癥應(yīng)答對(duì)于結(jié)核分枝桿菌的清除十分重要。細(xì)胞因子的分泌失衡是結(jié)核分枝桿菌引起疾病進(jìn)展的機(jī)制之一。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌感染后可觸發(fā)信號(hào)使巨噬細(xì)胞活化產(chǎn)生大量的效應(yīng)分子如IL-6、IL-1β和TNF-α等細(xì)胞因子[10]。本研究結(jié)果表明下調(diào)LRRK2可抑制BCG刺激誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和IFN-γ的表達(dá)，從而揭示LRRK2可正性調(diào)控巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染所產(chǎn)生的炎癥應(yīng)答。

NF-κB信號(hào)在炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答進(jìn)程中具有非常重要的作用[11]。進(jìn)而研究NF-κB通路是否參與LRRK2調(diào)控的炎癥反應(yīng)機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)LRRK2通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路抑制結(jié)核菌感染中的炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)過(guò)程，為進(jìn)一步闡明結(jié)核菌感染的免疫調(diào)控機(jī)制以及研發(fā)抗結(jié)核藥物提供了新的靶標(biāo)。

本研究結(jié)果揭示下調(diào)LRRK2可抑制BCG刺激誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)答進(jìn)程，進(jìn)而抑制結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存和繁殖，此外，LRRK2對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致炎癥的正調(diào)控作用是通過(guò)促進(jìn)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。綜上所述，LRRK2/NF-κB正反饋調(diào)控環(huán)在機(jī)體抗結(jié)核分枝桿菌感染過(guò)程中的免疫調(diào)控作用與機(jī)理，為進(jìn)一步研究結(jié)核分枝桿菌感染的致病機(jī)理提供了新的思路，并為研制臨床治療結(jié)核病的藥物研究提供了新的靶點(diǎn)。

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