任凱強(qiáng)，薛　萊，黃　波，潘文靖，吳　堃，蔣青松△

(1重慶醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016； 2江油市人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，四川 江油 621700； 3遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563003； 4重慶市人民醫(yī)院肝膽外科，重慶 400013)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是最常見的糖尿病類型，其主要病理特征為胰島素抵抗，常伴血糖升高和血脂紊亂。肝臟是調(diào)節(jié)糖、脂代謝最主要的器官，血液中糖脂水平失衡勢必影響肝臟的功能，甚至導(dǎo)致肝損傷。已有研究認(rèn)為，胰島素抵抗與T2DM和肥胖人群中肝病的發(fā)生密切相關(guān)[1-2]。在糖尿病患者和肥胖人群中，70%～90%的肝病發(fā)生與酒精過量攝取無關(guān)，而該比例在普通人群僅為20%～30%[3-4]。作為一種獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，糖尿病可導(dǎo)致肝損傷的發(fā)生和發(fā)展，故把糖尿病并發(fā)的肝損傷也稱為糖尿病肝病(diabetic hepatopathy)，其早期主要表現(xiàn)為非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)，以脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)聚集為主要特征。隨著病情進(jìn)展，NAFLD可能出現(xiàn)肝細(xì)胞損傷伴炎癥因子產(chǎn)生，發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)，進(jìn)一步惡化可進(jìn)展為肝纖維化，甚至出現(xiàn)肝硬化、肝細(xì)胞癌或肝功能衰竭等終末期肝病[5]。對于糖尿病引起的肝損傷，目前已經(jīng)進(jìn)行了較多研究，但其病理生理基礎(chǔ)仍然有待闡明。

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)屬于核受體家族成員，其作用與糖脂代謝、脂肪形成、炎癥及胰島素敏感性等生物學(xué)功能緊密相關(guān)[6]。PPARs有3種亞型，分別為PPARα、PPARβ和PPARγ。目前在糖尿病肝病中的研究主要集中于PPARα在NAFLD的作用，而對于PPARγ的研究較少，PPARβ的作用幾乎未見報(bào)道，且對于PPARs相關(guān)機(jī)制在糖尿病肝損傷中的作用缺乏系統(tǒng)研究。另外，目前有研究認(rèn)為，炎癥在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。當(dāng)炎癥細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1和IL-6等大量釋放，可促使糖尿病肝損傷惡化，從NAFLD進(jìn)展到NASH[7]。整體動物模型及離體細(xì)胞培養(yǎng)均已證實(shí)，PPARα、PPARβ和PPARγ可抑制核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)相關(guān)信號通路，從而抑制細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1和IL-6的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用[8]。作為NF-κB重要的下游因子，環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)及誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)在糖尿病肝病中的作用研究較少。故本實(shí)驗(yàn)擬利用高能量飼料喂養(yǎng)聯(lián)合多次腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導(dǎo)小鼠糖尿病模型，對PPARs-炎癥相關(guān)信號通路在糖尿病肝損傷中的作用進(jìn)行初步探索。

材　料　和　方　法

1　動物

SPF級4～6周齡雄性昆明小鼠，體重15～20 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號為SCXK(渝)2010-0001。

2　主要試劑

強(qiáng)生穩(wěn)豪型血糖儀及試紙購自強(qiáng)生(中國)醫(yī)療器材有限公司。STZ購自Sigma；胰島素放免檢測試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所；總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測試盒均購自南京建成生物技術(shù)公司；Trizol購自大連寶生物公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Supermix購自Bio-Rad；PCR引物由Invitrogen公司負(fù)責(zé)合成和純化；兔抗鼠PPARα和PPARγ多克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology；兔抗鼠PPARβ和COX-2多克隆抗體購自Cayman Chemical Company；兔抗鼠iNOS和β-actin多克隆抗體購自Abcam；兔抗鼠p-NF-κB p65多克隆抗體購自Cell Signaling Technology；山羊抗兔 IgG/HRP Ⅱ抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

3　主要方法

3.1糖尿病肝損傷模型建立小鼠用高糖高脂飼料(成分：10%蔗糖、10%蛋黃、10%豬油、1.5%膽固醇、0.5%膽鹽和68%基礎(chǔ)飼料混合)喂養(yǎng)4 周后，連續(xù)5 d腹腔注射STZ(溶于枸櫞酸緩沖液，pH 4.2～4.4，臨用前配制，劑量為40 mg·kg-1·d-1)。7 d后，檢測小鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)，F(xiàn)BG≥11.1 mmol/L視為糖尿病形成。糖尿病小鼠繼續(xù)給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后，檢測肝臟功能及形態(tài)變化，確定糖尿病肝損傷模型建立，即為模型(model)組。正常對照(control)組小鼠給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)4周后，連續(xù)5 d以等量枸櫞酸緩沖液腹腔注射，7 d后檢測小鼠FBG，然后繼續(xù)給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)4周。

3.2生化指標(biāo)測定眼眶采血，分裝后室溫靜置30 min，4 ℃、3 000×g離心15 min，取血清凍存于-20 ℃冰箱備用。按照各試劑盒說明書操作，ELx800酶標(biāo)儀(BioTek)分別檢測不同波長(TC和TG：490 nm；AST和ALT：510 nm；ALP：520 nm)的吸光度(A)。另外，使用SN-684型放射免疫計(jì)數(shù)器(上海核所日環(huán)光電儀器有限公司)以放免法檢測血清中胰島素含量(insulin，INS)，以mU/L表示，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=FBG×INS/22.5。每組結(jié)果來源于8只小鼠。

3.3組織病理學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死小鼠，分離肝臟，4%的多聚甲醛溶液固定6 h，用不同濃度的乙醇和二甲苯逐級脫水，石蠟包埋，作3～5 μm冠狀切片，HE染色，顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)改變。

3.4qPCR法檢測mRNA的表達(dá)參照GenBank中小鼠的基因序列合成目的基因引物(表1)，用Trizol法提取肝臟組織總RNA，按說明書操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用SYBR Green 熒光技術(shù)，在Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀按照如下反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增：95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參照，Ct值(熒光強(qiáng)度到達(dá)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù))為統(tǒng)計(jì)參數(shù)，相對定量法分析結(jié)果。每組重復(fù)3次。

表1　引物序列Table 1.The primer sequences for qPCR

3.5Western blot法檢測蛋白的表達(dá)取30 μg總蛋白加入含β-巰基乙醇的上樣緩沖液，高溫煮沸10 min使蛋白變性，行SDS-PAGE，PVDF轉(zhuǎn)膜，BSA封閉1 h，加入不同 I 抗(均1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗(1∶5 000稀釋)。洗膜后用發(fā)光液(Advanstor)顯色，凝膠成像儀與Image Lab軟件(Bio-Rad)照相顯影，分析結(jié)果。每組重復(fù)3次。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　小鼠糖尿病相關(guān)指標(biāo)的變化

給予STZ 7 d后，與對照組相比，模型組小鼠FBG顯著升高，從(5.20±0.25) mmol/L升高至(20.53±1.30) mmol/L (P<0.01)，遠(yuǎn)大于11.1 mmol/L，說明糖尿病形成；糖尿病形成4周后，模型組小鼠FBG升至(23.63±1.77) mmol/L，與同期正常對照組的FBG[(4.74±0.59) mmol/L]比較，升高了4.0倍(P<0.01)。糖尿病肝損傷模型組小鼠的血清胰島素水平亦明顯升高，為正常對照組的4.2倍(P<0.01)。同時(shí)，胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR增加了18.0倍(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The levels of insulin and HOMA-IR in diabetic hepatopathy mice.Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol group.
圖1糖尿病肝損傷小鼠血清胰島素和胰島素抵抗指數(shù)水平的變化

2　小鼠血脂及肝臟功能和形態(tài)的變化

與正常組相比，糖尿病肝損傷模型組小鼠的TC和TG均顯著升高(P<0.01)。同時(shí)，肝功能指標(biāo)ALT、AST和ALP分別亦顯著增加(P<0.01)，見表2。組織病理學(xué)檢測顯示，糖尿病形成4周后，糖尿病小鼠肝組織著色淺，肝小葉結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞排列明顯紊亂，腫脹明顯，胞漿內(nèi)可見大小不一脂滴，局部伴炎癥細(xì)胞浸潤，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂肪空泡，見圖2。

表2　小鼠血脂和肝功能的變化Table 2.The levels of TC,TG,ALT,AST and ALP in diabetic hepatopathy mice (Mean±SD.n=8)

**P<0.01vscontrol group.

Figure 2.The hepatic histopathology in diabetic hepatopathy mice (HE staining,×200).
圖2糖尿病肝損傷小鼠肝組織病理變化

3　糖尿病肝損傷小鼠肝臟PPARs mRNA和蛋白表達(dá)的變化

在糖尿病肝損傷小鼠中，其肝臟PPARα、PPARβ和PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.05或P<0.01)，見圖3。

Figure 3.The expression of PPARα,PPARβ and PPARγ at mRNA and protein levels in the livers of diabetic he-patopathy mice.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.
圖3糖尿病肝損傷小鼠肝臟PPARα、PPARβ和PPARγmRNA和蛋白表達(dá)的變化

4　糖尿病肝損傷小鼠肝臟NF-κB p65、iNOS和COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)的變化

在糖尿病肝損傷小鼠，其肝臟的NF-κB p65、iNOS和 COX-2的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.01)，見圖4。

Figure 4.The expressions of NF-κB p65,COX-2 and iNOS at mRNA and protein levels in the livers of diabetic he-patopathy mice.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.
圖4糖尿病肝損傷小鼠肝臟NF-κBp65、COX-2和iNOSmRNA和蛋白表達(dá)的變化

討　　論

肝損傷是糖尿病嚴(yán)重并發(fā)癥之一，具有較高的發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重影響了人類的生命健康和生活質(zhì)量。糖尿病肝損傷臨床癥狀表現(xiàn)較少且不典型，目前其發(fā)病機(jī)制尚未闡明。眾所周知，胰島素除了促進(jìn)糖原的合成和貯存，加速葡萄糖的氧化酵解，抑制糖原分解和糖異生外，還可促進(jìn)脂肪合成，抑制脂肪分解，減少游離脂肪酸和酮體生成，增加脂肪酸和葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)。糖尿病時(shí)由于胰島素抵抗，肝臟對胰島素作用的敏感性下降，導(dǎo)致肝臟葡萄糖排出增加和機(jī)體對葡萄糖的攝取及利用減少，TG合成增加；同時(shí)，外周脂肪組織裂解增加，肝臟脂肪酸的從頭合成途徑顯著提高，但其脂肪酸氧化及輸出較低，從而引起脂肪酸在肝臟堆積[9]。另外，胰島素抵抗時(shí)極低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein，VLDL)分泌減少，也進(jìn)一步增加肝臟脂肪聚集，引起NAFLD發(fā)生[1]。而大量脂質(zhì)堆積，誘導(dǎo)肝臟活性氧族(reactive oxygen species，ROS)、IL-6、C反應(yīng)蛋白等促炎因子增多，引起持續(xù)炎癥反應(yīng)，使NAFLD惡化進(jìn)展為NASH[10]。

本研究中，在高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合連續(xù)多次小劑量給予STZ后，模型組小鼠FBG水平一直高于11.1 mmol/L，提示糖尿病形成。糖尿病小鼠繼續(xù)予高能量飼料喂養(yǎng)4周，其血清胰島素水平和胰島素抵抗指數(shù)明顯增加；TC和TG水平升高，提示小鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的胰島素抵抗并伴隨體內(nèi)血糖、血脂水平異常。同時(shí)，模型組小鼠ALT、AST和ALP均顯著升高，提示其肝功能嚴(yán)重受損。組織形態(tài)學(xué)檢查顯示，在糖尿病形成4周后，出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性、炎性細(xì)胞浸潤等糖尿病肝病的典型表現(xiàn)。上述生化指標(biāo)結(jié)合組織病理學(xué)改變，提示糖尿病小鼠出現(xiàn)肝損傷的并發(fā)癥。

PPARs家族是調(diào)控代謝平衡、糖、脂和能量代謝及胰島素敏感性等的重要轉(zhuǎn)錄因子[6]。其中，PPARα主要通過調(diào)控脂肪酸代謝相關(guān)基因來調(diào)節(jié)脂類代謝，包括脂肪酸的β氧化及運(yùn)輸過程等，從而使TG、游離脂肪酸和 VLDL合成減少。PPARβ調(diào)節(jié)基因表達(dá)參與細(xì)胞的能量代謝、脂質(zhì)和葡萄糖的利用，維持機(jī)體能量平衡。PPARγ調(diào)控參與脂肪前體細(xì)胞分化的多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)胰島素介導(dǎo)的外周組織對葡萄糖的攝取，增加胰島素敏感性[11]。另外，炎癥細(xì)胞因子也是PPARs作用的靶標(biāo)之一。整體動物模型及離體細(xì)胞培養(yǎng)均已證實(shí)，PPARα、PPARβ和PPARγ具有明顯的抗炎作用[12]。PPARs激活后，通過作用于炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB，最終使趨化因子、細(xì)胞因子及黏附分子等的生成減少，產(chǎn)生抗炎作用，從而減輕組織損傷[13-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在糖尿病肝損傷小鼠，其肝臟PPARα、PPARβ及PPARγ mRNA及蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，而NF-κB的表達(dá)明顯升高，提示PPARs-NF-κB相關(guān)信號通路異常在糖尿病肝病中可能有重要作用。

NF-κB作為一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，是近年研究的熱點(diǎn)。NF-κB調(diào)控著多種基因的表達(dá)，在免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和腫瘤的發(fā)生發(fā)展，尤其是炎癥反應(yīng)中扮演著重要角色。NF-κB激活后導(dǎo)致大量促炎癥細(xì)胞因子，如IL-1、IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α等生成，使炎癥更進(jìn)一步加重。在NF-κB眾多的下游因子中，COX-2和iNOS屬于誘導(dǎo)型效應(yīng)酶，在大多數(shù)組織中基本不表達(dá)，但在一些炎癥因子、生長因子及促癌劑等的作用下表達(dá)增強(qiáng)。COX-2和iNOS基因啟動子區(qū)域含NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，NF-κB可通過作用于這些結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控COX-2和iNOS表達(dá)，激活NF-κB可激活COX-2和iNOS基因啟動子活性，上調(diào)兩者的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，參與多種病理生理過程[15]。我們前期研究表明[16]，NF-κB-COX-2/iNOS的激活參與了糖尿病心肌肥厚的損傷過程。那么，該通路在糖尿病肝損傷過程中是否也有類似的作用？在不同方法建立的NAFLD模型，其肝臟NF-κB、COX-2和iNOS表達(dá)都明顯上調(diào)[17-18]。本研究結(jié)果與之一致，在糖尿病肝病小鼠肝臟，隨著NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)的增加，COX-2和iNOS的表達(dá)也隨之增加。這些結(jié)果提示，NF-κB-COX-2/iNOS可能也參與了糖尿病肝病的炎癥損傷過程。

本研究結(jié)果提示糖尿病肝病的發(fā)生可能與PPARs-NF-κB-COX-2/iNOS信號通路異常有關(guān)。糖尿病時(shí)胰島素抵抗及血糖、血脂水平紊亂，PPARα、PPARβ及PPARγ表達(dá)下調(diào)，NF-κB活性增加，其下游炎癥因子COX-2和iNOS也隨之被激活，使NAFLD向NASH進(jìn)展，加重肝損傷。因此，PPARs-NF-κB-COX-2/iNOS信號通路可能是糖尿病肝損傷防治的重要干預(yù)靶點(diǎn)之一，激活PPARs或抑制NF-κB-COX-2/iNOS可能都有防治糖尿病肝病的作用。但糖尿病肝損傷的影響因素較為復(fù)雜，對于PPARs-炎癥相關(guān)信號通路在其中的作用還需進(jìn)行更多深入研究。

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