鐘　娟，青　姚，吳曙粵，龔?fù)?，龍海波?/p>

(1南寧市第一人民醫(yī)院，廣西 南寧 530022； 2南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院，廣東 廣州 510280)

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是以肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)貯積為特征的病理綜合征。隨著人們生活水平的提高，NAFLD在我國有顯著增多的趨勢，且日趨年輕化，近年來已超過病毒性肝炎而成為肝臟疾病的第1位[1]。其發(fā)病率高，后果嚴(yán)重，嚴(yán)重威脅我國人民健康。但目前NAFLD的機(jī)制仍未闡明，且無特異性藥物治療。近來大量的研究報道，厄貝沙坦(irbesartan)是獨(dú)特的血管緊張素受體阻滯劑(angiotensin receptor blockers，ARB)類降壓藥，除降壓之外，尚具有抗炎、抗氧化及調(diào)節(jié)糖、脂代謝的作用，能顯著改善代謝綜合征患者胰島素的抵抗，降低肝臟脂質(zhì)沉積，減緩肝脂肪變性的發(fā)生[2-4]，但其具體作用機(jī)理尚需進(jìn)一步明確。

自噬是一種進(jìn)化保守的溶酶體依賴的自身降解途徑，是細(xì)胞在遇到應(yīng)激反應(yīng)等刺激時，將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)多余的蛋白質(zhì)或損傷的細(xì)胞器等物質(zhì)包繞至自噬體中并與溶酶體結(jié)合將其降解的過程，其在真核細(xì)胞中廣泛存在。在人體饑餓狀態(tài)下，自噬可以通過增加肝臟的脂肪消耗，降低肝臟脂肪堆積，改善肝脂代謝紊亂，維持能量平衡。而當(dāng)肝臟中的脂質(zhì)聚積時，自噬作用受到抑制，其降解脂質(zhì)的作用降低，導(dǎo)致脂質(zhì)沉積進(jìn)一步加重，誘發(fā)NAFLD。因此，自噬在NAFLD的發(fā)生、發(fā)展中具有重要病理生理意義。研究發(fā)現(xiàn)有幾個信號通路與自噬的調(diào)節(jié)相關(guān)[5-6]，其中以Ⅰ類磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路最為典型。PI3K能夠磷酸化Akt，而磷酸化Akt可推動mTOR活化，進(jìn)而導(dǎo)致自噬抑制；相反，Akt的磷酸化受到抑制則能夠誘發(fā)高水平的自噬，這表明PI3K/Akt/mTOR能反向調(diào)節(jié)自噬。

因此，本研究采用先天瘦素受體基因缺失的db/db小鼠NAFLD動物模型，探討厄貝沙坦是否通過自噬調(diào)節(jié)改善db/db小鼠肝臟脂肪變以及PI3K/Akt/mTOR信號通路在其調(diào)節(jié)自噬中的影響，進(jìn)而為NAFLD的防治提供進(jìn)一步的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材　料　和　方　法

1　實(shí)驗(yàn)動物、藥物、試劑和儀器

雄性10周齡C57BL/KSJ-Lepdb (db/db)小鼠24只，同齡雄性C57BKSdb/m小鼠12只，均購自南京大學(xué)模式動物研究所,動物合格證號為 SCXK(蘇)2015-0001，飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心層流架內(nèi)。所有小鼠置于空氣流通、溫度22～25 ℃、濕度40%～70%的環(huán)境中，給予12 h光照，普通飼料喂養(yǎng)、自由飲水，遵循《南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理和使用指南》進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

厄貝沙坦片購自杭州賽諾菲制藥有限公司(國藥準(zhǔn)字J20080061，生產(chǎn)批號 5A173)；抗PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、自噬相關(guān)基因(autophage-related gene，Atg)-7、beclin-1、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)B、β-actin抗體購自CST，均為兔源單克隆抗體；BCA法蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司；ECL發(fā)光液購自Santa Cruz。Mini-Protein電泳槽購自Bio-Rad；Kodak Image Station 2000MM成像系統(tǒng)購自KODAK；光學(xué)顯微鏡為Nikon產(chǎn)品。

2　方法

2.1動物分組與治療將db/db小鼠隨機(jī)分為模型(model)組和厄貝沙坦(irbesartan)組，另選取db/m小鼠作正常對照(normal)組，每組12只。厄貝沙坦組予厄貝沙坦50 mg·kg-1·d-1經(jīng)口灌服治療(相當(dāng)于等倍人臨床用量)，模型組和正常對照組同時灌服等量生理鹽水，每天1次，共給藥16周。

2.2體重、肝指數(shù)、血脂及肝功能檢測在小鼠最后1次給藥后，禁食12 h，稱重，以0.3%戊巴比妥鈉按35 mg/kg的劑量腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，采用HITACHI 7180全自動生化儀檢測血甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平。取血后立即剝離肝組織，生理鹽水沖洗，濾紙吸干表面水分后稱重，計算肝指數(shù)：肝指數(shù)(%)=肝濕重/體重×100%。

2.3肝臟病理檢查各組肝組織標(biāo)本部分采用10%中性甲醛固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察。每組隨機(jī)選取6張切片采用NAS半定量評分系統(tǒng)對肝臟脂肪變程度進(jìn)行評定[7-8]：肝臟脂肪變<5%為0分；5%≤脂肪變<33%為1分；33%≤脂肪變<66%為2分；脂肪變≥66%為3分。部分肝組織冰凍切片后進(jìn)行油紅“O”染色，采用Image-Pro Plus 6.0(IPP)軟件對每張切片脂質(zhì)沉積進(jìn)行定量分析。

2.4Western blot檢測PI3K/Akt/mTOR信號通路及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)按照組織蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白。BCA蛋白定量法測各組蛋白濃度，以保證各組樣品上樣量相同。待測蛋白與5×上樣緩沖液按4∶1混合，98 ℃變性5 min。每組取蛋白80 μg，行SDS-PAGE分離，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，再用含5%脫脂奶粉的1×TBST緩沖液室溫?fù)u床上封閉1 h，TBST緩沖液漂洗后，各 I 抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌PVDF膜3次，每次10 min，封閉液稀釋相應(yīng)的 II 抗(1∶2 000)后，常溫下孵育1 h。TBST洗滌PVDF膜3次，每次10 min，ECL發(fā)光試劑盒在曝光儀中進(jìn)行曝光，以β-actin為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用Image Station 2000R圖像工作站采集圖像，進(jìn)行灰度分析。

2.5免疫組化檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3B的表達(dá)各組肝組織標(biāo)本采用10%中性甲醛固定，倒去固定液后流水沖洗5 min，各級乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟、包埋，切片機(jī)切成2 μm石蠟切片。新配3%H2O2孵育15 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，蒸餾水沖洗，封閉血清孵育 20 min。取LC3B 的I抗(1∶200)濕盒中4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，每次5 min；滴加 II 抗，室溫孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min；配制DBA顯色劑，孵育約10 min，自來水洗5 min，蘇木素復(fù)染10 min，自來水洗5 min。中性樹膠封片，光鏡下觀察、采集圖像。

2.6電鏡下觀察自噬小體取肝組織塊大小約1 mm×1 mm×1 mm，置于pH 7.4的2.5%冷戊二醛溶液中預(yù)固定，4 ℃保存。1周后用pH 7.4的1%四氧化鋨作后固定，固定24 h；之后梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋組織塊，修塊、切片，將超薄切片裱在小銅網(wǎng)上，用醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色，HITACHI H-7650透射電鏡觀察組織細(xì)胞中的自噬小體，照相并記錄隨機(jī)視野內(nèi)個數(shù)。

3　統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　厄貝沙坦對db/db小鼠體重、肝指數(shù)、血脂及肝功能的影響

結(jié)果顯示，與正常對照組db/m小鼠相比，模型組db/db小鼠體重、肝指數(shù)、血TG和TC以及ALT和AST均顯著升高(P<0.05)；經(jīng)厄貝沙坦治療16周后，db/db小鼠體重、肝指數(shù)、TG、TC、ALT和AST均有不同程度的降低，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見表1。

表1　厄貝沙坦對db/db小鼠體重、肝指數(shù)、血脂及肝功能的影響Table 1.The effect of irbesartan on body weight,liver index,serum lipid and liver function in db/db mice (Mean±SD.n=12)

*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsmodel group.

2　厄貝沙坦對db/db小鼠肝臟病理的影響

肝組織經(jīng)HE染色后光鏡下可見正常對照組肝細(xì)胞排列整齊;模型組出現(xiàn)明顯的肝細(xì)胞脂肪變性，以大量肝細(xì)胞空泡性變、細(xì)胞脫落為特征,模型組NAS定量評分明顯高于正常對照組;經(jīng)厄貝沙坦干預(yù)后，db/db小鼠肝臟脂肪變性明顯減輕，NAS定量評分顯著降低，與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。肝組織油紅“O”染色可見模型組肝細(xì)胞內(nèi)大量脂質(zhì)沉積，經(jīng)IPP軟件定量分析顯示模型組油紅“O”染色平均陽性面積達(dá)70%以上，明顯高于正常對照組(P<0.05);經(jīng)厄貝沙坦治療后，可見db/db小鼠肝臟脂質(zhì)沉積明顯減少，油紅“O”染色平均陽性面積低于40%，見圖1。

3　Western blot檢測厄貝沙坦對自噬相關(guān)蛋白Atg-7、beclin-1和LC3B表達(dá)的影響

與正常對照組相比，模型組db/db小鼠肝組織自噬相關(guān)蛋白Atg-7、beclin-1和LC3B-Ⅱ表達(dá)明顯減少(P<0.05)；經(jīng)厄貝沙坦干預(yù)后，db/db小鼠肝組織自噬相關(guān)蛋白Atg-7、beclin-1和LC3B-Ⅱ表達(dá)明顯增加，與模型組相比有顯著差異(P<0.05)，見圖2。表明厄貝沙坦可以通過增加自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)肝臟自噬的發(fā)生，但其調(diào)節(jié)自噬上述蛋白表達(dá)的具體機(jī)制仍有待明確。因此，我們進(jìn)一步采用Western blot檢測PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。

4　Western blot檢測厄貝沙坦對PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響

模型組db/db小鼠肝組織p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的表達(dá)較正常對照組小鼠顯著增加(P<0.05)；然而經(jīng)厄貝沙坦干預(yù)后，db/db小鼠肝組織p-PI3K、p-Akt和p-mTOR表達(dá)顯著減少，與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步研究表明厄貝沙坦上調(diào)自噬相關(guān)蛋白Atg-7、beclin-1和LC3B-Ⅱ的表達(dá)可能與其抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路有關(guān)，見圖3。

Figure 1.The pathological changes of hepatic tissues in the mice of each group.Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsmodel group.
圖1各組小鼠肝組織病理變化

Figure 2.Irbesartan induced autophagy in the livers ofdb/dbmice.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsmodel group.
圖2厄貝沙坦對自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

5　免疫組化檢測厄貝沙坦對自噬標(biāo)志蛋白LC3B表達(dá)的影響

LC3B為自噬標(biāo)志蛋白，模型組db/db小鼠肝組織LC3B較正常對照組db/m小鼠顯著減少(P<0.05)；然而經(jīng)厄貝沙坦干預(yù)后，db/db小鼠肝組織LC3B表達(dá)顯著增多，與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

6　厄貝沙坦對db/db小鼠肝臟自噬小體表達(dá)的影響

自噬小體是由單層膜或典型雙層膜將一小部分細(xì)胞質(zhì)包圍而成，通過透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)模型組db/db小鼠肝細(xì)胞自噬小體數(shù)量較正常對照組相比有減少趨勢，但經(jīng)厄貝沙坦治療后，db/db小鼠肝細(xì)胞自噬小體數(shù)量較模型組顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

Figure 3.Irbesartan inhibited the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in the livers ofdb/dbmice.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsmodel group.
圖3厄貝沙坦對PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響

Figure 4.Immunohistochemical staining of LC3B in the livers of the mice (×200).Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsmodel group.
圖4免疫組化檢測厄貝沙坦對LC3B表達(dá)的影響

討　　論

NAFLD是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷。 NAFLD 經(jīng)歷 “二次打擊”后可激發(fā)非酒精性脂肪性肝炎，由此將進(jìn)展為肝硬化、終末期肝病甚至肝癌，而危及生命[4]。Wong等[9]進(jìn)行的一項(xiàng)基于人群的前瞻性隊(duì)列研究顯示，3～5年內(nèi)13.5%的成人(年齡≥18歲，無NAFLD)會發(fā)生NAFLD。目前NAFLD發(fā)病率正在以驚人的速度增長，且將近50%的NAFLD患者有高血壓[10]。但是，NAFLD至今尚無特效治療方法，以往期求于降脂/調(diào)脂藥物并不能達(dá)到治療的目的，且長期服用又易引起肝腎功能損害。因此，探索機(jī)制明確、治療有效的藥物是當(dāng)今研究的重點(diǎn)。

NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，一般認(rèn)為脂質(zhì)攝取過多和胰島素抵抗是引起脂類在肝臟細(xì)胞中聚集的首要環(huán)節(jié)，線粒體的氧化應(yīng)激以及各種細(xì)胞因子的綜合作用最終導(dǎo)致了肝細(xì)胞的脂肪變性。新近有研究報道肝細(xì)胞自噬的活性影響肝臟脂質(zhì)沉積，肝臟自噬增加能有效地減輕肝臟脂肪性變和肝損傷。Kim等[11]在肥胖患者和脂肪肝大鼠中發(fā)現(xiàn)，肝臟內(nèi)自噬抑制物的過度激活可減少肝臟細(xì)胞的自噬總量。同時，肝臟細(xì)胞自噬的減少會促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素抵抗。體外研究也顯示，通過基因敲除、沉默或者藥物抑制自噬后，高脂誘導(dǎo)的肝細(xì)胞由于自噬的抑制而使細(xì)胞脂肪酸β氧化減少，致使脂滴中蓄積過量的甘油三酯和膽固醇，并且自噬與脂代謝之間的相互作用會陷入惡性循環(huán)，細(xì)胞自噬減少導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)存積，而脂質(zhì)大量存積將進(jìn)一步抑制細(xì)胞自噬功能，從而進(jìn)一步加重脂質(zhì)滯留[12]。因此，促進(jìn)細(xì)胞自噬可調(diào)節(jié)脂代謝，減少肝臟脂質(zhì)沉積，改善胰島素抵抗，減輕肝臟脂肪性變和肝損傷。

Figure 5.The effect of irbesartan on the formation of autophagosomes in the hepatocytes observed by transmission electron microscopy.The arrows indicated autophagosomes.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsmodel group.
圖5厄貝沙坦對db/db小鼠肝臟形成自噬小體的影響

厄貝沙坦為血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑，在臨床上主要用于降血壓治療,并可能通過腎素-血管緊張素-醛固酮統(tǒng)起到肝臟保護(hù)的作用。近來大量的臨床及實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)，厄貝沙坦尚具有抗炎、抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮以及調(diào)節(jié)糖、脂代謝的作用，可用于NAFLD、代謝綜合征、動脈粥樣硬化等疾病的治療[2-4,8]。研究報道厄貝沙坦通過改善胰島素抵抗、降低固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c (sterol regulatory element binding protein -1c，SREBP1c)表達(dá)、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，從而減輕高脂飼養(yǎng)的SD大鼠、FLS-ob/ob小鼠以及肥胖Zucker大鼠肝臟的脂肪性變[3-4,13]。此外，也有研究證實(shí)厄貝沙坦可以通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPAR-γ)，上調(diào)PPAR-γ/HGF和AMPK/Akt/mTOR信號通路，減輕高脂飼養(yǎng)ApoEKO小鼠和2型糖尿病db/db小鼠肝臟脂肪性變[2,8]。另外，Rong等[14]研究發(fā)現(xiàn)，厄貝沙坦亦可激活PPAR-α，促進(jìn)肥胖Koletsky大鼠肝臟PPAR-α及其相關(guān)基因的表達(dá)，從而減少游離脂肪酸的含量、改善高甘油三酯血癥。然而，目前隨著自噬在肝臟疾病中的深入研究，自噬水平的變化對肝臟生理功能和疾病發(fā)生的影響及如何通過調(diào)控自噬治療肝臟疾病、是否厄貝沙坦亦可通過調(diào)節(jié)自噬改善NAFLD及其相關(guān)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)通過采用先天瘦素受體基因缺失db/db小鼠NAFLD動物模型，觀察厄貝沙坦對db/db小鼠肝臟脂肪變的影響及作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)厄貝沙坦干預(yù)后，db/db小鼠體重、肝指數(shù)、血脂、肝功能及肝臟脂肪變性均顯著改善，與模型組相比有統(tǒng)計學(xué)意義。而且，經(jīng)厄貝沙坦治療后，db/db小鼠肝組織自噬相關(guān)蛋白Atg-7、beclin-1和LC3B表達(dá)均明顯增加，與模型組比較亦有統(tǒng)計學(xué)意義。LC3B為自噬形成標(biāo)志蛋白，包括LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ，而LC3B-Ⅰ需在Atg-7等蛋白的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)長C3B-Ⅱ，最終形成自噬小體。本實(shí)驗(yàn)通過Western blot和免疫組化2種方法均發(fā)現(xiàn)厄貝沙坦治療后db/db小鼠肝組織LC3B-Ⅱ表達(dá)明顯增加，而且通過透射電鏡進(jìn)一步觀察，亦發(fā)現(xiàn)厄貝沙坦治療后db/db小鼠肝細(xì)胞自噬小體也明顯增多，提示厄貝沙坦可能通過促進(jìn)肝細(xì)胞自噬從而減輕db/db小鼠肝臟脂肪變。此外，本實(shí)驗(yàn)亦通過Western blot方法檢測各組肝組織PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，模型組肝組織p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的表達(dá)顯著增加，而經(jīng)厄貝沙坦干預(yù)后，肝組織p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表達(dá)顯著減少，進(jìn)一步研究表明厄貝沙坦上調(diào)自噬相關(guān)蛋白Atg-7、beclin-1和LC3B-Ⅱ的表達(dá)可能與其抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路有關(guān)。

綜上所述，厄貝沙坦具有有效防治脂肪肝的作用，其機(jī)制可能與其抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，上調(diào)自噬相關(guān)蛋白Atg-7、beclin-1和LC3B-Ⅱ的表達(dá)，從而促進(jìn)肝細(xì)胞自噬有關(guān)。

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