賀　欣，張目涵，路　瑤，樓江明，趙美華，馬　娜，馮百歲

(鄭州大學第二附屬醫(yī)院消化內科，鄭州大學第二附屬醫(yī)院炎癥性腸病中心，吳階平醫(yī)學基金會中國炎癥性腸病聯(lián)盟河南省炎癥性腸病中心，河南 鄭州 450014)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種病因尚不是十分清楚的累及腸道各個部位的特發(fā)性炎癥性疾病，其具體發(fā)病機制可能是遺傳基因易感性、腸黏膜免疫平衡紊亂和腸道內微生物菌群失調等多種因素共同導致了腸黏膜屏障的損傷，并進一步加劇了IBD疾病發(fā)病的過程[1-2]。由2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)誘導的小鼠結腸炎模型是模擬IBD發(fā)病機制的傳統(tǒng)疾病模型，其中TNBS與50 %乙醇溶液混合后共同對小鼠的結腸炎模型進行誘導[3]。黏蛋白2(mucin 2，MUC2)是一種主要附著在腸道黏液層表面上的高度糖基化修飾的大分子黏液狀糖蛋白物質。MUC2的蛋白主體不僅可以潤滑和保護腸黏膜上皮，并且附著在黏蛋白表面上的糖鏈還可以參與細胞間的信號轉導和腸黏膜相關免疫因子的調控[4]。而細菌鞭毛蛋白作為存在于腸道微生物表面鞭毛上的主要組成成分，同樣也成為IBD疾病發(fā)生過程中的重要毒性成分和抗原成分[5]。近年來已經有研究發(fā)現(xiàn)血清內的細菌免疫標志物抗CBir1鞭毛蛋白抗體可以作為代表腸道內細菌鞭毛蛋白的主要血清標志物[6]。因此，本實驗在TNBS誘導的經典結腸炎小鼠模型的基礎上進一步使用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和卵清蛋白(ovalbumin，OVA)作為TNBS模型的激活劑，并以酮替芬(ketotifen)作為TNBS模型的抑制劑，通過使用PAS染色法和免疫組織化學法對各模型組小鼠腸組織MUC2的表達進行測定，并用ELISA方法進一步測量各組小鼠血清中細菌免疫標志物抗CBir1抗體的水平，對MUC2在各種結腸炎小鼠模型中的保護作用進行探究，并對腸道內MUC2與細菌鞭毛蛋白之間表達量的相關性進行進一步的了解。

材　料　和　方　法

1　實驗動物和試劑

6～8周齡SPF級健康雄性BALB/c小鼠共60只，購于河南省實驗動物中心。TNBS、LPS、OVA和富馬酸酮替芬購于Sigma；小鼠抗CBir1抗體ELISA試劑盒購于R&D；山羊抗小鼠MUC2抗體購于UCL；過碘酸溶液、Schiff試劑、蘇木素染色液和4%多聚甲醛溶液購于鼎國生物有限公司；阿利新藍溶液購于博奧森生物技術公司。

2　方法

2.1實驗分組60只小鼠隨機分為正常對照(normal control)組、TNBS組、LPS+OVA+TNBS組和酮替芬+TNBS組，共4組，每組15只。各組小鼠均為雄性，且各組小鼠體重等一般情況情況沒有差別。其中正常對照組在第1天、第8天和第15天分別用100 μL生理鹽水進行灌腸；TNBS組在第1天用2.0 mg TNBS和50%乙醇混合成100 μL溶液灌腸，第8天用2.5 mg TNBS和50%乙醇混合成100 μL溶液灌腸，第15天用3.0 mg TNBS和50%乙醇混合成100 μL溶液灌腸；LPS+OVA+TNBS組在TNBS組灌腸基礎上將10 μg LPS和20 μg OVA共同溶于100 μL生理鹽水中，并分別于第7天、第9天、第12天和第15天時對小鼠進行腹腔注射，之后再將50 μg OVA溶于100 μL生理鹽水后于第18～21天期間每日繼續(xù)對小鼠進行腹腔注射；酮替芬+TNBS組在TNBS組灌腸基礎上將0.5 mg酮替芬溶于100 μL生理鹽水中，并在每次灌腸前30 min對小鼠進行腹腔注射。

2.2小鼠疾病活動情況的評估每日測定小鼠的體重變化并進行比較，同時觀察各組小鼠的大便性狀以及大便潛血的情況。根據McCarthy等[7]在文獻中制定的疾病活動度指數(shù)(disease activity index，DAI)評分標準得出每組小鼠的平均 DAI評分，以評估各組小鼠的疾病活動情況。根據DAI 評分的標準，動物無體重下降，大便性狀正常，無大便潛血/肉眼血便者為0分；動物體重下降達1%～5%，大便松散，潛血陽性者為1分；動物體重下降達6%～10%，大便松散，潛血陽性者為2分；動物體重下降達11%～15%，稀便，肉眼血便者為3分；動物體重下降>15%，稀便，肉眼血便者為4分。

2.3標本的采集和處理第22天時用摘除眼球的方式處死小鼠。收集各組小鼠血液并行2 000～2 500 r/min 離心20 min，之后收集上清液保存在-20 ℃冰箱中以備檢測。同時取小鼠中段結腸組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，并制成石蠟切片后放置在4 ℃冰箱保存。將HE染色后的切片放置在光學顯微鏡下觀察各組切片的組織病理學改變，并根據Dieleman等[8]制定的組織學指數(shù)(histological index，HI)評分標準進行評分：無炎癥、無病變、無隱窩破壞者計0分；輕度炎癥、病變深度達黏膜下層、基底 1/3 隱窩被破壞、病變范圍達1%～25%者計1分；重度炎癥、病變深度達肌層、基底 2/3 隱窩被破壞、病變范圍達26%～50%者計2分；重度炎癥、病變深度達漿膜層、僅有完整表面上皮、病變范圍達51%～75%者計3分；全部隱窩和上皮被破壞、病變范圍達76%～100%者計4分。

2.4PAS染色法檢測結腸組織MUC2的表達取小鼠結腸組織石蠟切片，脫蠟后加入1%阿利新藍染液進行30 min染色。蒸餾水洗凈后加入過碘酸液靜置10 min，充分水洗后再加入Schiff試劑繼續(xù)染色15 min。吸干Schiff試劑后水洗，之后用蘇木素染液對細胞核進行染色。脫水，透明，并用中性樹膠封片進行封固。每組于光學顯微鏡下隨機選取3個PAS染色的組織隱窩區(qū)域進行觀察，其中滿杯狀細胞的鏡下充滿了PAS染色的顆粒和黏液，空杯狀細胞在PAS染色后顆粒和黏液缺失，并且細胞的頂端表面出現(xiàn)深凹變化。

2.5免疫組化方法檢測結腸組織MUC2的表達取小鼠結腸組織石蠟切片，脫蠟和水化后于37 ℃條件下滴加山羊抗小鼠MUC2抗體，4 ℃冰箱過夜并于第2天加入生物素標記的 Ⅱ 抗孵育。PBS沖洗后用DAB顯色液進行顯色。之后用蘇木素對細胞核進行染色1 min，脫水，封片。在顯微鏡下隨機選擇5個視野觀察，以胞漿內發(fā)現(xiàn)棕褐色顆粒的細胞作為陽性細胞，其中陽性細胞在視野中的百分比0～25%為0分，26%～50%為1分，50%～75%為2分，>75%為3分。染色強度輕度著色記為1分，中度著色記為2分，重度著色記為3分。以上兩項判定標準中得分之和大于等于3分為陽性，小于3分為陰性。

2.6血清抗CBir1抗體的ELISA檢測設置空白孔和待測樣品孔，并分別在孔內進行加樣，加樣后進行封板并在37 ℃環(huán)境中孵育30 min。之后用洗滌液洗板5次，并在各個孔中均加入顯色劑A和顯色劑B各50 μl，于37 ℃陰暗處顯色15 min，最后加入終止液終止。用酶標儀中的450 mm波長分別測量各個孔的吸光度(A)，并最終得出樣品的實際濃度。

3　統(tǒng)計學處理

所有實驗數(shù)據均用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行處理，定量資料采用平均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，方差齊性用Levene方法檢驗，多組數(shù)據采用單因素方差分析，有意義的數(shù)據采用LSD-t法進一步兩兩比較。率的比較采用卡方檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結　　果

1　各組小鼠一般狀況及DAI評分比較

正常對照組的15只小鼠食量正常，反應靈活，體重有所增加；TNBS組的15只小鼠在灌腸后均出現(xiàn)不同程度的身體蜷縮、食量減少，軟便或稀便增多和體重下降等癥狀，并于灌腸后出現(xiàn)2只小鼠死亡的現(xiàn)象；LPS+OVA+TNBS組的15只小鼠較TNBS組體重下降更明顯，消瘦和血便更加明顯，有5只小鼠先后在造模過程中死亡，將死亡小鼠進行腸道解剖后肉眼觀察小鼠全部結腸段均出現(xiàn)血紅色；而酮替芬+TNBS組小鼠與TNBS組相比癥狀減輕，食量和體重有所恢復，并且大便性狀好轉。對各組進行DAI評分見表 1。

2　各組小鼠結腸黏膜組織學改變

光學顯微鏡下觀察各組小鼠結腸組織切片可見，正常對照組結腸黏膜完整，結構清晰，腺體排列規(guī)則并且僅見很少量炎性細胞浸潤；TNBS組結腸可見黏膜上皮小片狀壞死，黏膜層內大量淋巴細胞浸潤并且杯狀細胞數(shù)量減少。LPS+OVA+TNBS組小鼠組結腸組織學損傷程度比TNBS組更加嚴重，結腸黏膜正常腺體結構消失，黏膜下層和肌層均可見淋巴細胞等炎性滲出物，并且炎癥波及腸壁全層；酮替芬+TNBS組與TNBS組相比黏膜層炎癥程度較輕，但仍有少量淋巴細胞浸潤，并且杯狀細胞仍有所減少，見圖1。各組小鼠結腸黏膜的HI評分見表1。

表1　各組小鼠一般狀況、DAI評分和結腸黏膜HI評分的比較Table 1.General status,DAI score and HI score of colonic mucosa in each group

*P<0.05vsnormal control group；△P<0.05vsTNBS group.

Figure 1.HE staining of colonic mucosa in each group (×200).
圖1各組小鼠結腸黏膜HE染色

3　各組小鼠腸組織PAS染色和MUC2含量的比較

各組的PAS染色結果可見，正常對照組的結腸隱窩內均可發(fā)現(xiàn)大量杯狀細胞中的MUC2被染成橘紅色；TNBS組中可見杯狀細胞有所減少，基底隱窩處可發(fā)現(xiàn)細長中斷的MUC2；LPS+OVA+TNBS組中已經出現(xiàn)黏膜破裂的表現(xiàn)，并且尚未發(fā)現(xiàn)有明顯的杯狀細胞和MUC2的染色；酮替芬+TNBS組與TNBS組相比MUC2的含量有所增高，但與正常對照組相比黏蛋白的含量和杯狀細胞數(shù)量仍有所減少，見圖2。

Figure 2.PAS staining for observing the content of MUC2 in the intestinal tissues of the mice with different treatments (×100).
圖2PAS染色中各組小鼠腸道組織MUC2含量的比較

4　小鼠腸組織免疫組化染色中MUC2的表達

免疫組化結果可見，正常對照組的MUC2表達于大量結腸黏膜隱窩的杯狀細胞內和少量上皮細胞內，并且染色陽性結果位于細胞質內；而與正常對照組相比，TNBS組、LPS+OVA+TNBS組和酮替芬+TNBS組染色強度均有不同程度減弱并且MUC2的含量均有降低。運用上述的半定量評分標準對觀察結果進行分析顯示，與正常對照組相比，TNBS組、LPS+OVA+TNBS組、酮替芬+TNBS組結腸黏膜MUC2表達陽性率均明顯降低；與TNBS組相比，LPS+OVA+TNBS組結腸黏膜MUC2表達陽性率進一步降低，而酮替芬+TNBS組結腸黏膜MUC2表達陽性率則有所回升(P<0.05)，見圖3、表2。

Figure 3.The content of MUC2 in the colon tissues of each group in the mice (immunohistochemical staining，×400).
圖3各組小鼠結腸組織中MUC2含量的比較

5　各組小鼠血清抗CBir1抗體的濃度結果

與正常對照組相比，TNBS組、LPS+OVA+TNBS組和酮替芬+TNBS組的血清抗CBir1抗體濃度明顯增高；并且與TNBS組相比，LPS+OVA+TNBS組的血清抗CBir1抗體濃度更加增高，酮替芬+TNBS組血清抗CBir1抗體濃度則有所降低(P<0.05)，見表2。

討　　論

IBD是一類發(fā)病原因不清，發(fā)病機制復雜，并且目前沒有很好的治愈性措施的疾病，近年來其在我國的發(fā)病率有著明顯增高的趨勢[9]。由TNBS溶液誘導的小鼠結腸炎模型是可以模擬IBD發(fā)病過程的經典模型之一，其在腸道內主要通過誘發(fā)Th1型免疫反應從而在腸道免疫調節(jié)紊亂方面促進了小鼠結腸炎的發(fā)展[10]。LPS又被稱為細菌內毒素，是構成革蘭陰性厭氧菌細胞壁的主要成分[11]。LPS主要通過作用于細胞膜上的Toll樣受體家族和后續(xù)的骨髓樣分化因子88等胞內信號轉導途徑，從而進一步誘導了淋巴細胞和肥大細胞等各種免疫細胞合成和釋放細胞因子，介導腸道內的炎癥反應過程[12]。而OVA是一種通常被用來與半抗原相偶聯(lián)從而合成完全抗原的載體蛋白，當LPS與這類載體蛋白結合之后便可以加強對后續(xù)免疫應答的修飾[13]。已經有哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的動物模型中使用了LPS和OVA共同誘導氣道表面微生物菌群的失調，并最終誘發(fā)了呼吸道炎癥反應的發(fā)生[14]。本實驗的結果也可以發(fā)現(xiàn)，LPS+OVA+TNBS模型組小鼠的DAI評分和HI評分與TNBS組相比均有所上升，說明了在TNBS傳統(tǒng)模型的基礎上加用LPS和OVA，可以對TNBS模型小鼠在腸道微生物失調方面進一步對腸黏膜進行破壞。酮替芬是一種可以作用于肥大細胞細胞膜上的炎癥反應保護劑，其主要通過減少肥大細胞細胞膜的變構從而阻止其釋放炎癥反應相關的過敏性介質[15-16]。已經有研究發(fā)現(xiàn)在IBD的小鼠模型中肥大細胞的數(shù)量可以增加到10倍以上[17]。而本實驗的結果也發(fā)現(xiàn)，酮替芬+TNBS組的DAI評分和HI評分雖然與正常對照組相比依然有所增高，但是與TNBS組模型組相比則明顯降低，說明了酮替芬可以通過抑制TNBS模型小鼠腸黏膜內肥大細胞激活的方式從而緩解腸道炎癥反應的發(fā)生。

表2各組小鼠MUC2在結腸組織中的免疫組化定量和血清抗CBir1抗體濃度的比較
Table 2.The expression level of MUC2 in colonic tissue of mice determined by immunohistochemical method and serum anti-CBir1 antibody concentration measured by ELISA (Mean±SD.n=15)

GroupMUC2positiveAnti?CBir1antibody(ng/L)Normalcontrol13(86．7%)26．34±2．41TNBS6(40．0%)?45．99±3．92?LPS+OVA+TNBS4(26．7%)?△51．83±3．62?△Ketotifen+TNBS11(73．3%)?△32．45±2．66?△

*P<0.05vsnormal control group；△P<0.05vsTNBS group.

黏蛋白是一類廣泛存在于各個組織和器官中的高相對分子質量并且高度糖基化修飾的蛋白家族。正常情況下的黏蛋白不僅其蛋白主體可以對上皮細胞和組織進行潤滑和保護，并且附著在蛋白主體上的眾多糖鏈還可以在細胞信號轉導、淋巴循環(huán)、抗原提呈甚至是活化免疫細胞等各方面均發(fā)揮重要作用[18]。目前已經發(fā)現(xiàn)的黏蛋白共有20多種，其中來自于腸道內的MUC2是參與構成腸黏膜屏障最重要的糖蛋白。MUC2主要在腸道杯狀細胞中產生并在其內部進行糖基裝配和分泌，因此附著在MUC2主體上的糖鏈也為腸道內正常菌群和一些免疫球蛋白的黏附提供了位點[4,19]。已經有研究發(fā)現(xiàn)腸黏膜MUC2的缺失可以引發(fā)結腸癌和細菌性腹瀉等腸道內相關疾病的發(fā)生[20-21]，從而推測MUC2在IBD的發(fā)生發(fā)展中也可以起到重要的腸道保護作用。本實驗的PAS染色結果中，可見TNBS組與正常對照組相比出現(xiàn)了細長中斷的基底隱窩黏蛋白并且杯狀細胞數(shù)量也相對有所減少；更加嚴重的LPS+OVA+TNBS組已經出現(xiàn)黏膜破裂現(xiàn)象，并且沒有發(fā)現(xiàn)明顯的杯狀細胞和黏蛋白的染色；而酮替芬+TNBS組黏蛋白的含量要比TNBS組高。之后進一步用免疫組化方法再次對腸道組織MUC2的表達進行觀察后發(fā)現(xiàn)，TNBS組、LPS+OVA+TNBS組和酮替芬+TNBS組與正常對照組相比MUC2的表達均有所減少；LPS+OVA+TNBS組與TNBS組相比，結腸黏膜MUC2的表達量更加減少；而酮替芬+TNBS組與TNBS組相比結腸黏膜MUC2的表達量則有所回升，并且半定量分析差別均具有統(tǒng)計學意義。

除腸黏膜免疫反應失衡以外，腸道微生物菌群的失調在IBD發(fā)病機制中也具有非常關機鍵的地位。細菌鞭毛蛋白是存在于細菌表面絡合物的重要物質，其最先在自發(fā)性結腸炎的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，并代表著細菌的活力和黏附方面的能力。已經有研究表明細菌鞭毛蛋白可以在組織內激活TLR5受體，從而促發(fā)后續(xù)炎癥反應[22-23]。而最近也有研究發(fā)現(xiàn)其在IBD的發(fā)病過程中也具有重要意義[24]。在腸道細菌介導下的炎癥反應過程中會出現(xiàn)很多具有代表性的血清免疫標志物，其中最典型的標志物抗CBir1抗體既是對特定細菌產生免疫反應之后在血清中表達的產物，也是反映人體腸道和微生物菌群之間發(fā)生相互作用的一種標志性物質[25]。本實驗用ELISA的方法對血清抗CBir1抗體的濃度進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)LPS+OVA+TNBS模型組中抗CBir1抗體的表達明顯高于正常對照組和TNBS組，而酮替芬+TNBS組與TNBS組相比抗CBir1的表達量則有所降低。同時在上述免疫組化染色的實驗結果中還可以發(fā)現(xiàn)MUC2在腸道的潰瘍部位及其附近水腫區(qū)，或是隱窩膿腫的隱窩上皮增生處等表達均有減低，因此更加說明了細菌鞭毛蛋白可以破壞各組小鼠腸黏膜內以MUC2為主的黏液狀保護層并趁機從破潰的腸道中進入血液，使得后續(xù)微生物和免疫反應可以更加直接地對腸道進行損害。而腸道內完整的MUC2則可以阻擋細菌鞭毛蛋白等有害物質的入侵從而對腸道進行保護。

綜上所述，本實驗在小鼠結腸炎TNBS模型的基礎上用LPS和OVA作為激活劑并用酮替芬作為抑制劑進一步進行干預，從而說明了MUC2不僅可以在各種結腸炎模型中起到附著于腸道黏液層的物理保護作用，還可以在IBD的免疫失衡和微生物菌群失調等因素中發(fā)揮著抗炎反應的調控。并且腸黏膜MUC2的分泌與腸道內破壞性物質細菌鞭毛蛋白的表達也存在著一定負相關。有關MUC2與腸黏膜屏障和細菌鞭毛蛋白等物質的具體關系和作用機制仍不是十分清楚，因此有待于更多的后續(xù)實驗對此進行更加深入的研究。

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