孫滿意，李　寧，馬金鳳，李克忠

(1山東大學第二醫(yī)院，山東 濟南 250033； 2青島大學附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院，山東 青島 264000)

術后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是一種以認知能力下降為特點的臨床綜合征[1]。隨著人口老齡化的加速以及手術覆蓋率的上升，越來越多的老年人面臨發(fā)生POCD的風險[2]。異氟醚(isoflurane，Iso)是一種臨床常用的吸入麻醉藥，研究證實經異氟醚暴露的老年小鼠出現(xiàn)認知功能下降，其機制可能與異氟醚誘導的神經細胞凋亡有關[3-4]。但是異氟醚引起細胞凋亡的具體機制尚不明確。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)神經生長因子(nerve growth factor，NGF)的前體(precursor form of NGF，proNGF)與其受體p75NTR特異性結合(proNGF-p75NTR),可以激活下游凋亡信號通路，誘導細胞凋亡[5-6]。而proNGF-p75NTR是否參與異氟醚誘導的老年小鼠中樞神經細胞凋亡，目前國內外尚未見報道。2-氨基-3-甲基-戊酸酰胺(LM11A-31，LM)是一種水溶性異亮氨酸衍生物，分子量為243.3 kD，是p75NTR受體特異性抑制劑[7-9]。本研究采用LM11A-31預處理擬行異氟醚暴露的老年小鼠，觀察其對異氟醚誘導的認知損害和神經細胞凋亡通路的影響，探討異氟醚介導的老年小鼠中樞神經毒性的相關機制，為尋找臨床干預靶點提供實驗基礎和理論依據(jù)。

材　料　和　方　法

1　動物

IVC級C57BL/6J雄性老年小鼠30只，13～14月齡，體重30～35 g，購自山東大學實驗動物中心(生產許可證：魯20130009)。

2　主要試劑

異氟醚購自雅培制藥有限公司；Morris水迷宮系統(tǒng)購自北京眾實迪創(chuàng)；兔抗小鼠p75NTR、p-p38 MAPK和cleaved caspase-3抗體購自CST；兔抗小鼠proNGF抗體購自Alomone Labs； p75NTR抑制劑LM11A-31購自Ricerca Biosciences。動脈血氣分析儀購自Abbott。

3　主要方法

3.1LM11A-31灌胃按照隨機數(shù)表將30只老年小鼠隨機分為3組：正常(control)組、異氟醚(Iso)組和異氟醚聯(lián)合LM11A-31(LM+Iso)組，每組10只。參照文獻[10]的方法并加以調整，將LM11A-31溶于無菌生理鹽水中，并按照劑量 50 mg·kg-1·d-1對LM+Iso組老年小鼠進行灌胃，其余2組用等體積生理鹽水灌胃，灌胃時間為1個月。

3.2異氟醚暴露灌胃結束后，將各組小鼠置于密閉麻醉箱中，使用氣體監(jiān)測儀持續(xù)監(jiān)測箱內異氟醚、CO2和O2的濃度。麻醉箱底部浸于37 ℃的恒溫水浴箱中。參照文獻[11]的方法，將Iso組和LM+Iso組小鼠暴露于1%異氟醚3 h，異氟醚以空氣(21%氧氣混合79%氮氣)輸送，連續(xù)7 d； control組小鼠吸入空氣3 h，連續(xù)7 d。

3.3生理指標監(jiān)測第7天異氟醚暴露后15 min，記錄小鼠呼吸頻率。在麻醉結束時即刻，每組小鼠(n=10)經左心室心臟穿刺抽血行血氣分析。

3.4Morris 水迷宮實驗末次異氟醚暴露結束后24 h行Morris 水迷宮實驗。在定位航行實驗中，記錄小鼠搜尋平臺的逃避潛伏期。第4天訓練完成后，行空間探索實驗，此時平臺從第Ⅰ象限移除，小鼠從平臺放置象限相對的象限即第Ⅲ象限入水，每次小鼠進入游泳60 s后停止，記錄目標象限穿越次數(shù)。

3.5Western blot 法測定蛋白表達水迷宮測試結束后，各組小鼠予腹腔注射20%烏拉坦1.2 g/kg 麻醉后斷頭，冰臺上迅速分離海馬組織，用勻漿法提取海馬組織總蛋白。各組等量樣本行5%～10%的SDS-PAGE，分離后的蛋白濕轉至PVDF 膜上，使用5% 的脫脂奶粉封閉1 h，分別孵育相應 I 抗[兔抗小鼠p75NTR抗體(1∶1 000)、兔抗小鼠p-p38 MAPK抗體(1∶1 000)、兔抗小鼠cleaved caspase-3抗體(1∶1 000)、兔抗小鼠proNGF抗體(1∶1 000)和兔抗小鼠β-actin抗體(1∶3 000)]，4 ℃孵育過夜。第2天用 TBST洗膜3次，加山羊抗兔 II 抗 (1∶4 000)，37 ℃孵育1 h后充分洗膜3次，采用ECL化學發(fā)光法顯影，使用Fusion-FX7 Spectra凝膠成像圖像分析系統(tǒng)進行免疫印跡膜的成像與電泳條帶的半定量分析。

4　統(tǒng)計學處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結　　果

1　生理指標監(jiān)測

如表1所示，各組小鼠的pH值、氧分壓(partial pressure of oxygen，PO2)、二氧化碳分壓(partial pressure of carbon dioxide，PCO2)和血氧飽和度(arterial oxygen saturation，SaO2)值均在正常范圍內。

表1生理指標監(jiān)測
Table 1.The physiological monitoring indicators (Mean±SD.n=10)

GrouppHPO2(mmHg)PCO2(mmHg)SaO2(%)Control7．32±0．05245±2041．0±3．099．0±0．1Iso7．31±0．04240±2243．1±2．599．0±0．1LM+Iso7．34±0．03251±2143．7±3．299．0±0．1

2　小鼠海馬組織中proNGF和p75NTR蛋白的變化

與control組比較，Iso組海馬組織中的proNGF和p75NTR的表達水平顯著增加(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.Western blot was used to determine the protein expression of proNGF and p75NTR.Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.
圖1Westernblot檢測proNGF和p75NTR的蛋白表達

3　小鼠海馬組織中磷酸化p38 MAPK水平的變化

Iso組海馬組織中p38 MAPK的磷酸化水平較control組顯著升高(P<0.01)； LM+Iso組p38 MAPK的磷酸化水平較Iso組顯著下降(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.Western blot was used to determine the protein levels of phosphorylated p38 MAPK (p-p38 MAPK) and cleaved caspase-3.Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsIso group.
圖2Westernblot檢測p-p38MAPK和cleavedcaspase-3的蛋白水平

4　小鼠海馬組織中cleaved caspase-3的水平改變

Iso組海馬組織中的cleaved caspase-3表達水平較control組顯著升高(P<0.01)，而LM11A-31干預可以明顯緩解異氟醚誘導的cleaved caspase-3蛋白水平的升高(P<0.01)，見圖2。

5　小鼠行為學的改變

如表2所示，定位航行實驗中，Morris水迷宮前2 d，各組小鼠的逃避潛伏期的差異無統(tǒng)計學顯著性；從第3天開始，Iso組小鼠找尋平臺的潛伏期明顯長于control組(P<0.01)，而LM+Iso組小鼠的逃避潛伏期較Iso組小鼠顯著縮短(P<0.01)。空間探索的實驗結果可見，與control組相比，Iso組小鼠穿越原平臺次數(shù)減少(P<0.01)；LM+Iso組小鼠穿越原平臺次數(shù)較Iso組小鼠增加(P<0.01)，見表2。

表2　不同處理對Morris水迷宮實驗結果的影響Table 2.The results of Morris water maze test (Mean±SD.n=10)

*P<0.01vscontrol group;#P<0.01vsIso group.

討　　論

隨著POCD在老年患者中的發(fā)病率逐漸增高，患者的生活質量受到嚴重影響，因此積極研究疾病機制以及尋找治療靶點已成為目前亟待解決的問題。本研究發(fā)現(xiàn)，在老年小鼠中，異氟醚通過上調proNGF與其受體p75NTR的表達，激活下游p38 MAPK信號分子磷酸化，從而激活cleaved caspase-3凋亡級聯(lián)反應。而p75NTR受體抑制劑LM11A-31可以顯著下調以上凋亡信號相關分子，進而改善異氟醚誘導的老年小鼠認知功能下降。

NGF是神經營養(yǎng)因子家族中的一員，在中樞神經系統(tǒng)的病理生理活動中發(fā)揮了重要作用[12]。有研究報道，腦室內注射NGF可以促進大鼠海馬區(qū)突觸囊泡蛋白增加以及提高學習記憶能力[13]。NGF基因敲除小鼠表現(xiàn)出明顯的膽堿能神經元丟失的特征[14]。生理情況下，NGF的前體proNGF在中樞神經系統(tǒng)較少表達，而在應激或疾病狀態(tài)下，proNGF表達上調，參與神經退行性病變過程[15-18]。p75NTR屬于跨膜I型蛋白，在神經系統(tǒng)廣泛表達，proNGF通過與其特異性結合，介導神經細胞的凋亡發(fā)生[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默病以及唐氏綜合征等神經退行性疾病中，proNGF在大腦內大量沉積，影響膽堿能神經元供能，引起神經纖維纏結，導致神經元凋亡[7,14,16]。還有研究發(fā)現(xiàn)，高表達的proNGF通過p75NTR介導了癲癇大鼠模型海馬神經元凋亡[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，老年小鼠在異氟醚暴露后，proNGF以及p75NTR在海馬組織中的表達顯著上調，說明proNGF-p75NTR信號增強，很可能介導了異氟醚的神經毒性病理過程。

p38 MAPK磷酸化可以通過影響線粒體功能，從而激活caspase-3級聯(lián)反應，增加cleaved caspase-3的蛋白水平，最終導致細胞凋亡[20-22]。有研究報道，糖尿病視網膜疾病中，proNGF通過激活下游p38 MAPK信號通路，介導視網膜細胞的凋亡發(fā)生[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，p-p38 MAPK以及cleaved caspase-3的蛋白水平在異氟醚暴露的老年小鼠海馬組織中升高，說明凋亡信號的激活可能與proNGF-p75NTR信號相關。我們進一步采用p75NTR特異性抑制劑LM11A-31以探討proNGF-p75NTR在神經凋亡信號通路中的作用。結果發(fā)現(xiàn)，LM11A-31阻斷p75NTR可以明顯緩解p38 MAPK磷酸化水平以及cleaved caspase-3水平的升高，說明proNGF-p75NTR的激活參與了異氟醚介導的老年小鼠凋亡信號通路活化。另外，Morris水迷宮的行為學結果顯示，LM11A-31干預可顯著改善異氟醚誘導的老年小鼠認知功能下降，進一步說明proNGF-p75NTR信號通路的激活可能參與了異氟醚誘導的神經毒性反應。曾有研究表明，LM11A-31阻斷p75NTR可以明顯緩解阿爾茨海默病小鼠模型中的神經炎癥、β淀粉樣沉積以及tau蛋白磷酸化，最終提高小鼠的行為學成績[7,10]。因此調控proNGF-p75NTR可能是改善異氟醚誘導的神經病變以及提高認知功能的潛在靶點。

綜上所述，我們認為proNGF與其受體p75NTR特異性結合參與了異氟醚暴露的老年小鼠凋亡信號通路的活化以及認知功能下降的病理過程，這為尋找臨床干預措施提供了理論基礎。

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