王雪，甄璟然，孫正怡，郁琦，鄧成艷，周遠(yuǎn)征，王含必

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心，北京 100730)

胚胎的冷凍保存是輔助生殖技術(shù)(ART)治療中的重要組成部分，通過冷凍保存可以將患者過多的胚胎保存下來，提高患者的累積妊娠率。胚胎的冷凍保存可以在胚胎發(fā)育的任意階段進(jìn)行，如有的中心常規(guī)冷凍原核期胚胎或卵裂期胚胎，現(xiàn)在隨著培養(yǎng)體系的完善，越來越多的IVF中心進(jìn)行囊胚培養(yǎng)以期提高妊娠率和降低多胎妊娠率，因此研究者更傾向于進(jìn)行囊胚冷凍保存。冷凍方法可以為程序化慢速冷凍，也可以為玻璃化冷凍。我們中心自2004年起，對(duì)第3天移植后的胚胎全部進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，如有囊胚形成則進(jìn)行玻璃化冷凍保存。然而在臨床工作中常存在一些偶發(fā)的意外情況，如患者在復(fù)蘇移植日因突發(fā)性原因無法進(jìn)行胚胎移植，只能將復(fù)蘇的胚胎丟棄或再次冷凍后擇期復(fù)蘇移植。但是我們無法確定囊胚二次玻璃化冷凍后的安全性如何。目前關(guān)于人類胚胎二次冷凍的文獻(xiàn)較少，盡管有文獻(xiàn)報(bào)道了一些病例能夠在胚胎二次冷凍復(fù)蘇移植后獲得活產(chǎn)，但這些報(bào)道多為第一次冷凍為原核期胚胎或卵裂期胚胎，復(fù)蘇后培養(yǎng)至囊胚再次冷凍[1-4]。Kumasako等[3]認(rèn)為二次冷凍不會(huì)降低胚胎的種植率，但是關(guān)于囊胚冷凍復(fù)蘇后再次冷凍復(fù)蘇移植的報(bào)道極少。且據(jù)我們所知，尚無研究來分析囊胚二次玻璃化冷凍復(fù)蘇移植后的出生結(jié)局。在此病例報(bào)道中，我們描述了囊胚二次冷凍復(fù)蘇移植后新生兒的出生結(jié)局，并對(duì)此患者的孩子進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪觀察，詳細(xì)記錄了此兒童的體格發(fā)育情況。

一、臨床資料

患者34歲，丈夫35歲，因輸卵管因素原發(fā)不孕到我院生殖中心就診，不孕年限6年。根據(jù)世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)，男方精液參數(shù)正常?；颊?005年在本中心進(jìn)行卵巢刺激后取卵，在取卵周期所采用的促排卵方案按照本中心的常規(guī)進(jìn)行，在上一周期的黃體期開始應(yīng)用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a)，當(dāng)垂體達(dá)到降調(diào)節(jié)后，用卵泡刺激素(FSH，果納芬，默克)進(jìn)行卵巢刺激。當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)到18～20 mm時(shí)，注射人絨毛膜促性腺激素(HCG，艾澤，默克)，38 h后進(jìn)行陰道超聲引導(dǎo)的卵泡穿刺來獲取卵母細(xì)胞。共獲得13枚卵母細(xì)胞，進(jìn)行常規(guī)授精后，13枚卵母細(xì)胞受精，在受精后第3天觀察胚胎的卵裂情況，挑選2枚優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植。移植后剩余的11枚卵裂期胚胎經(jīng)患者知情同意后全部進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，在受精后第5日或第6日分別觀察囊胚形成情況及形態(tài)。采用Gardner評(píng)分系統(tǒng)對(duì)囊胚進(jìn)行評(píng)分，該患者共形成2枚囊胚，囊胚評(píng)分分別為4BB和4BC。將所形成的囊胚按照我中心常規(guī)方法[5]進(jìn)行玻璃化冷凍，具體操為：囊胚冷凍前進(jìn)行人工皺縮，即用激光系統(tǒng)在遠(yuǎn)離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的滋養(yǎng)細(xì)胞連接薄弱處打孔，讓囊腔液流出，使細(xì)胞皺縮成團(tuán)；然后將囊胚放入含有7.5% DMSO和7.5%乙二醇的預(yù)平衡液中平衡2 min，之后移入玻璃化冷凍液中平衡30 s，將胚胎轉(zhuǎn)移至冷凍環(huán)(cryoloop環(huán))上，直接浸入液氮保存。

患者新鮮周期移植未獲得妊娠，取卵3個(gè)月后患者進(jìn)行冷凍囊胚復(fù)蘇移植。人工周期準(zhǔn)備內(nèi)膜，月經(jīng)第2～4天行常規(guī)B超檢查，給予戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂，先靈，德國(guó))口服，口服劑量根據(jù)患者以往的內(nèi)膜情況調(diào)整(2～18 mg/d)。B超監(jiān)測(cè)內(nèi)膜生長(zhǎng)情況，當(dāng)內(nèi)膜厚度達(dá)到8 mm時(shí)肌肉注射黃體酮(20 mg×2 d，40 mg×2 d，20～40 mg×1 d)，注射后第6天行囊胚復(fù)蘇移植。移植前1 d按照我中心常規(guī)方法[5]進(jìn)行囊胚復(fù)蘇：準(zhǔn)備囊胚復(fù)蘇液，在胚胎培養(yǎng)皿內(nèi)配制0.33 mol/L、0.2 mol/L蔗糖溶液和基礎(chǔ)培養(yǎng)液(G-MOPS Plus，Vitrolife，瑞典)，從液氮中取出帶有囊胚的冷凍環(huán)，空氣中停留5 s后，將胚胎依次浸入上述復(fù)蘇液中，時(shí)間分別為2 min、3 min和5 min。復(fù)蘇后的2枚囊胚均進(jìn)行激光輔助孵化，選擇在遠(yuǎn)離細(xì)胞團(tuán)的透明帶上部位切割透明帶的1/4左右。之后將囊胚移入提前準(zhǔn)備好的囊胚培養(yǎng)液(G2，Vitrolife，瑞典)中，放置37℃、6%CO2和5%O2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16 h。移植前觀察囊胚的擴(kuò)張和孵出情況。

該患者在囊胚復(fù)蘇移植日突發(fā)急性闌尾炎不能進(jìn)行囊胚移植，在患者知情同意的前提下再次按照上述囊胚玻璃化冷凍操作步驟進(jìn)行胚胎冷凍?；颊呤中g(shù)6個(gè)月后再次進(jìn)行冷凍囊胚復(fù)蘇移植，具體操作步驟同上，囊胚復(fù)蘇后16 h進(jìn)行移植，患者成功妊娠，并于孕38周分娩一健康女嬰，體長(zhǎng)52 cm，體重3 550 g。由于這是本中心第1例囊胚二次冷凍的患者，所以我們對(duì)其女進(jìn)行了長(zhǎng)期的隨訪。孩子的父親身高為185 cm，母親身高為167 cm；孩子1歲時(shí)，身高83 cm，體重12 kg；3歲時(shí)，身高97 cm，體重21 kg，身體健康，無疾??；5歲時(shí)，身高117 cm，體重31 kg；7歲時(shí)，身高135 cm，體重40 kg；9歲時(shí)身高154 cm，體重50 kg；12歲時(shí)，身高168 cm，體重62 kg；10歲時(shí)，乳房出現(xiàn)發(fā)育；12歲時(shí)月經(jīng)初潮。該女孩性格開朗，參加學(xué)校管樂隊(duì)、?；@球隊(duì)等集體活動(dòng)，并取得很好的成績(jī)，其智力正常，學(xué)習(xí)成績(jī)?cè)诎嗉?jí)前5名。

二、討論

在此病例中，患者獲得13枚成熟卵母細(xì)胞，13枚卵母細(xì)胞受精，經(jīng)過培養(yǎng)后形成2枚囊胚并玻璃化冷凍保存?；颊咴陬A(yù)定囊胚復(fù)蘇移植日突發(fā)急性闌尾炎，在其知情同意的前提下將復(fù)蘇后的囊胚再次冷凍保存。此為臨床工作中一些難以避免的情況。如果將患者胚胎丟棄非?？上?，而胚胎再次冷凍保存的安全性尚不明確。到目前為止，雖然已經(jīng)有一些胚胎在二次冷凍后獲得活產(chǎn)的病例報(bào)道，但都是第一次胚胎冷凍時(shí)為原核期或卵裂期胚胎，復(fù)蘇后培養(yǎng)至囊胚階段再次冷凍。本研究是首次對(duì)囊胚二次玻璃化冷凍后獲得的活產(chǎn)進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪的病例報(bào)道。

有學(xué)者曾經(jīng)用小鼠胚胎研究反復(fù)冷凍復(fù)蘇對(duì)胚胎的影響，他們發(fā)現(xiàn)與未冷凍的胚胎相比，冷凍胚胎在孵出時(shí)的細(xì)胞數(shù)略少，且小鼠胚胎能夠在成功的反復(fù)冷凍復(fù)蘇3次后仍然具有體外發(fā)育能力[6]。在此病例中，我們對(duì)比了兩次冷凍前后囊胚的形態(tài)學(xué)變化，第1次冷凍是在第5天，囊胚為4期，質(zhì)量為4BB，第一次復(fù)蘇后培養(yǎng)16 h，囊胚完全孵出，成為6期囊胚，質(zhì)量為6BB；第2次冷凍復(fù)蘇后，培養(yǎng)16 h囊胚質(zhì)量為6BB。囊胚形態(tài)從外觀上看，兩次冷凍后沒有差異，囊胚細(xì)胞存活良好，貌似囊胚階段胚胎的二次玻璃化冷凍對(duì)胚胎的發(fā)育無太大影響。分析原因，我們認(rèn)為可能與以下幾個(gè)方面有關(guān)。首先，囊胚在冷凍之前進(jìn)行了激光皺縮，將囊胚腔內(nèi)液全部放出，使囊胚腔塌陷，待囊胚完全皺縮后再進(jìn)行囊胚的玻璃化冷凍，這樣能夠減少冷凍過程中冰晶的形成，降低對(duì)胚胎的損傷。有研究也證實(shí)囊胚的人工皺縮能夠有效提高囊胚冷凍后復(fù)蘇的存活率[7-9]。而且冷凍囊胚復(fù)蘇后的輔助孵化也非常重要，在胚胎冷凍過程中，人類囊胚的透明帶變硬，會(huì)限制胚胎的向外孵出，有研究認(rèn)為囊胚在擴(kuò)張過程中不斷地膨脹皺縮，如果在透明帶出口處卡的次數(shù)多了，囊胚就會(huì)衰亡[10]。而且，冷凍復(fù)蘇后的囊胚，由于剛剛復(fù)蘇后囊胚腔還處于皺縮狀態(tài)，胚胎和透明帶之間的間隙遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于卵裂期胚胎的間隙，因此囊胚的輔助孵化更安全。我們的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)過輔助孵化的囊胚，復(fù)蘇后過夜培養(yǎng)，完全孵出的比例(34%)遠(yuǎn)低于激光孵化后的囊胚(85%)，更高的孵出比例意味著更高的著床機(jī)會(huì)。其次，囊胚的冷凍保存不同于卵裂期胚胎，它自身有很多優(yōu)點(diǎn)。能夠發(fā)育至囊胚階段的胚胎經(jīng)過二次選擇，發(fā)育能力異常的胚胎已經(jīng)被淘汰；囊胚的細(xì)胞數(shù)目多，尤其是滋養(yǎng)細(xì)胞層細(xì)胞，損傷后修復(fù)能力強(qiáng)，少數(shù)細(xì)胞死亡后對(duì)胚胎發(fā)育能力影響小；囊胚的細(xì)胞更小，呈梭形，表面積/體積比大，對(duì)脫水、復(fù)水造成的體積變化耐受性更佳[11]。因此我們猜測(cè)囊胚二次冷凍后細(xì)胞沒有損傷的原因可能與此有關(guān)。

目前雖然有一些胚胎二次冷凍獲得活產(chǎn)的報(bào)道，但是對(duì)新生兒長(zhǎng)期隨訪的報(bào)道非常少見。在此病例中，囊胚經(jīng)過二次玻璃化冷凍后，仍然能夠成功種植，患者在足月分娩一正常體重的新生兒，也提示囊胚二次冷凍似乎并不影響新生兒的出生結(jié)局。復(fù)習(xí)文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)在2011年的一項(xiàng)小型研究中，作者分析了一次冷凍和二次冷凍后胚胎出生結(jié)局的差異[12]。在文中一次冷凍，就是將2PN期或卵裂期的胚胎進(jìn)行冷凍保存，復(fù)蘇后移植；二次冷凍指的是冷凍的胚胎復(fù)蘇后進(jìn)行體外培養(yǎng)至囊胚階段，再進(jìn)行冷凍。結(jié)果提示二次冷凍組的雙胎率低于一次冷凍組，他們認(rèn)為是二次冷凍組移植的胚胎數(shù)較少造成的。此研究還提示二次冷凍組的出生體重略高于一次冷凍組，盡管沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在二次冷凍組未發(fā)生先天異常，在一次冷凍組發(fā)生1例先天異常；兩組均未發(fā)生死胎或新生兒死亡。盡管這些并非囊胚二次冷凍的研究，但從一定程度上反映了胚胎在二次冷凍后并不影響新生兒的出生結(jié)局。我們對(duì)此新生兒隨訪至9歲，該兒童體格發(fā)育正常，智力發(fā)育正常，心理發(fā)育正常。與之前凍融胚胎移植(FET)出生兒童的隨訪結(jié)論一致[13-17]。Pelkonen等[13]分析了FET出生孩子的先天異常的發(fā)生情況，認(rèn)為FET出生孩子發(fā)生先天異常的比例與新鮮移植相似，之后Pelkonen等[14]對(duì)FET后代孩子進(jìn)行了一項(xiàng)隨訪3年的研究，發(fā)現(xiàn)FET與新鮮移植出生后代的體格發(fā)育是相似的。還有研究發(fā)現(xiàn)ART后出生后代的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)發(fā)育方面與自然妊娠后代無顯著差異，認(rèn)為他們的神經(jīng)發(fā)育、社會(huì)感情及語言學(xué)習(xí)并無差異[16-17]?？梢娕咛ダ鋬鰧?duì)新生兒長(zhǎng)期發(fā)育的影響與新鮮移植胚胎相似。而從我們的病例報(bào)道來看，囊胚的二次冷凍也是相對(duì)安全的。

我們將囊胚二次玻璃化冷凍后的胚胎進(jìn)行移植后獲得成功妊娠，足月分娩一健康女嬰，并進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)12年的隨訪，此兒童體格發(fā)育正常，智力發(fā)育正常，心理發(fā)育正常。認(rèn)為此囊胚二次冷凍后胚胎仍然具有很好的種植潛能和發(fā)育潛能。但此病例僅為個(gè)例報(bào)道，囊胚反復(fù)冷凍是否會(huì)造成胚胎的損傷仍不明確，移植反復(fù)冷凍的胚胎是否安全還需要進(jìn)一步的研究，因此在臨床工作中，我們?nèi)詰?yīng)盡可能避免胚胎的反復(fù)凍融。