紀(jì)冰，王凱凱，趙紅梅，董艷，孟瑋，邢敏，孫吉花

（濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1.檢驗科，2.感染管理辦公室，山東 濱州 256603）

金黃色葡萄球菌是臨床分離常見致病菌，由于可以釋放多種毒素等原因造成致病力很強(qiáng)，是現(xiàn)代臨床感染性疾病中非常重要的病原菌[1]。金黃色葡萄球菌在獲得mecA基因后成為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Meticillin - resistant staphylococcus aureus，MRSA），MRSA對多種抗生素表現(xiàn)多重耐藥且耐藥性逐年上升，已經(jīng)成為現(xiàn)代臨床抗感染治療的難題之一[2]。本研究通過多位點測序分型聯(lián)合SCCmec基因分型對MRSA進(jìn)行基因分型以了解濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的主要流行株情況，并探討不同基因型與藥敏譜的關(guān)系，明確MRSA的起源、傳播和流行特征，制定本地區(qū)最佳防治措施?，F(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1　菌株來源

收集本院2013年3月-2015年11月臨床分離的經(jīng)德國西門子公司W(wǎng)alkWAY96 PLUS全自動微生物分析儀鑒定為金黃色葡萄球菌，頭孢西丁紙片擴(kuò)散法進(jìn)行篩選，用PCR方法檢測mecA基因確認(rèn)為MRSA共67株。金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29213和ATCC43300購于中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會臨床檢驗中心。

1.2　儀器和試劑

WalkWAY96 PLUS全自動微生物分析儀，溶葡萄球菌酶、細(xì)菌DNA提取試劑盒、引物、1 000 bp DNA ladder Marker、PCR試劑均購自上海生物工程有限公司，PC33鑒定藥敏復(fù)合板購自德國西門子公司。

1.3　藥物敏感試驗

采用WalkWAY96 PLUS自動微生物分析儀PC33鑒定藥敏復(fù)合板和Kirby-Bauer法檢測抗菌藥物的敏感性，共測試17種抗菌藥物，分別為：青霉素、氨芐西林、苯唑西林、利奈唑胺、替考拉寧、萬古霉素、環(huán)丙沙星、莫西沙星、左氧氟沙星、氯霉素、克林霉素、紅霉素、慶大霉素、利福平、四環(huán)素、復(fù)方新諾明及米諾環(huán)素。

1.4　SCCmec基因分型檢測

對金葡菌DNA提取后進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，分型引物/擴(kuò)增及反應(yīng)條件均依據(jù)ZHANG等[3]的報道，根據(jù)擴(kuò)增條帶分為5型。標(biāo)準(zhǔn)陽性對照菌株：NCTC10042（SCCmecⅠ型）、N315（SCCmecⅡ型）、85/2080（SCCmecⅢ型）、JCSC4744（SCCmecⅣ型）、HS663（SCCmecⅤ型）由濱州醫(yī)學(xué)院微生物教研室張玉梅惠贈。標(biāo)準(zhǔn)陽性對照菌株保證在規(guī)定實驗條件下，保證每次結(jié)果的質(zhì)量控制，與標(biāo)準(zhǔn)菌株出現(xiàn)相同產(chǎn)物長度條帶為該SCCmec型別，SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及V型分別出現(xiàn)613、398、280、776及325 bp條帶。

1.5　MLST分型

提取金黃色葡萄球菌DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增金葡菌染色體DNA上的7個管家基因arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi及yqiL的可變區(qū)片段。引物序列依據(jù)MLST網(wǎng)站，PCR擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物送上海生物工程公司進(jìn)行雙向測序，將所測序列與WWW.mlst.net上公布的管家基因的等位基因進(jìn)行比較，從而獲得所測金黃色葡萄糖球菌的7個管家基因的等位基因譜，然后提交MLST網(wǎng)站根據(jù)等位基因譜確定其序列分型（sequence type，ST）。利用eBURST軟件分析ST分型結(jié)果，最后得出細(xì)胞克隆株（clonal complex，CC）來源。

1.6　方法

采用eBURST軟件分析ST分型結(jié)果，采用Whonet 5.6軟件進(jìn)行細(xì)菌耐藥性分析。

2　結(jié)果

2.1　SCCmec基因分型結(jié)果

在檢測的67株MRSA中，SCCmecⅢ型菌株63株，占94.03%，SCCmecⅣ菌株4株，占5.97%。SCCmecⅢ型和SCCmecⅥ型陽性對照菌株與檢測陽性菌株產(chǎn)物分別于280和776 bp出現(xiàn)條帶。PCR擴(kuò)增結(jié)果見附圖。

2.2　MLST分型結(jié)果

經(jīng)PCR分別擴(kuò)增67株MRSA的7個管家基因，擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后測序，最后提交MLST網(wǎng)站分析，本研究共檢出6個ST型。見表1。

附圖　MRSA的SCCmec多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜

2.3　不同基因型的藥物敏感試驗結(jié)果

6種型別MRSA菌株對青霉素、氨芐西林等β-內(nèi)酰胺類抗生素完全耐藥，對萬古霉素、利奈唑烷和替考拉寧完全敏感，ST239-MRSA-SCCmecⅢ、ST399-MRSA-SCCmecⅢ及 ST121-MRSA-SCCmecⅣ均為多重耐藥株（對3種類型以上的抗菌藥物耐藥），ST88-MRSA-SCCmecⅣ、ST221-MRSA-SCCmecⅣ及ST82-MRSA-SCCmecⅣ對非β-內(nèi)酰胺類的抗菌藥物多表現(xiàn)敏感，為非多重耐藥。見表2。

表1　67株MRSA的MLST結(jié)果

表2　不同ST-MRSA-SCCmec基因型別耐藥率 %

3　討論

金黃色葡萄球菌可以引起醫(yī)院和社區(qū)諸如心內(nèi)膜炎、菌血癥、肺炎等可危及生命的嚴(yán)重感染性疾病，由于金黃色葡萄糖球菌在獲得mecA基因成為MRSA后的多藥耐藥性和交叉耐藥性特點使臨床治療非常棘手，致臨床治療難以控制，目前已成為臨床抗感染治療的一大難題，現(xiàn)在不同地區(qū)MRSA的起源、控制醫(yī)院內(nèi)傳播和耐藥特征已成為國內(nèi)外耐藥監(jiān)測和流行病學(xué)監(jiān)測的熱點和重點。在眾多基因分型方法中，由ENRIGHT等[4]建立的MLST聯(lián)合SCCmec基因分型方法將MRSA的群體生物學(xué)、致病性和進(jìn)化等遺傳特征和SCCmec染色體盒耐藥基因特征相結(jié)合對MRSA進(jìn)行分析，該技術(shù)操作簡單易行，可重復(fù)性強(qiáng)，由于有固定MLST互聯(lián)網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫故可以實現(xiàn)不同實驗室之間進(jìn)行信息互相傳遞和比較分析，現(xiàn)在已被國際臨床微生物界認(rèn)定是定義MRSA克隆株的參考方法，適用于公共衛(wèi)生、分子流行病學(xué)和群體進(jìn)化學(xué)研究。通過對國際上的MRSA進(jìn)行MLST聯(lián)合SCCmec基因分型技術(shù)分型發(fā)現(xiàn)目前主要有5個MRSA流行克?。篠T250-MRSA-SCCmecⅠ（First株 ）、ST247-MRSA-SCCmecⅠ（Iberian株 ）、ST5-MRSA-SCCmecⅡ（NewYork/Japan株）、ST239-MRSA-SCCmecⅢ（Brazilian/Hungarian株）及ST5-MRSA-SCCmecⅣ（Pediatric）。本研究 67株 MRSA流行的主要是ST239-MRSA-Ⅲ，與大部分亞洲國家[5]和國內(nèi)楊延成[6]研究ST239-MRSA-Ⅲ主要流行株相同，ST239-MRSA-Ⅲ屬于國際流行克隆株中的Brazilian/Hungarian株，也是我國醫(yī)院獲得性感染MRSA主要流行株，而研究中ST399-MRSA-SCCmecⅢ、ST121-MRSA-SCCmecⅣ、ST88-MRSA-SCCmecⅣ、ST221-MRSA-SCCmecⅣ及ST82-MRSA-SCCmecⅣ都不是國際流行克隆株，在國內(nèi)外也能散發(fā)檢測到，要求進(jìn)一步研究其基因特征來確定菌株起源。63株SCCmecⅢ型MRSA有2型ST型別，相對于SCCmecⅢ型MRSA，SCCmecⅣ型MRSA顯示了更為多樣化的ST分型特點，4株就檢測出4型不同的ST型別。所以SCCmecⅣ型MRSA菌株與SCCmecⅢ型相比具有完全不同菌株起源背景和進(jìn)化路線，提示在濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院SCCmecⅣ型MRSA可能存在獨特的遺傳背景和進(jìn)化傳播方式。MLST聯(lián)合SCCmec基因分型技術(shù)的最主要優(yōu)勢是已經(jīng)建立了存有大型基因型數(shù)據(jù)庫的國際網(wǎng)站，不同國家，不同地區(qū)的實驗室可以將自己的檢測結(jié)果提交基因型數(shù)據(jù)庫與公認(rèn)的已有的流行株進(jìn)行比較和分析，可以對不同實驗室分離的MRSA的遺傳背景和進(jìn)化傳播路線進(jìn)行相關(guān)性分析，實現(xiàn)世界范圍內(nèi)的流行病學(xué)調(diào)查，監(jiān)測是否出現(xiàn)國際流行MRSA克隆株，這樣可以防止和控制國際流行MRSA株感染的爆發(fā)和流行。

SCCmec分型與藥物敏感試驗結(jié)果結(jié)合分析顯示SCCmecⅢ型的MRSA株均表現(xiàn)為多重耐藥（對3類藥物及以上耐藥定義為多重耐藥），而SCCmecⅣ型MRSA均未表現(xiàn)為多重耐藥，藥物敏感試驗結(jié)果顯示對紅霉素、左氧氟沙星等非β-內(nèi)酰胺類的抗菌藥物多為表現(xiàn)為敏感，現(xiàn)有研究已經(jīng)明確Ⅲ型與Ⅳ型MRSA耐藥性差異與不同型別SCCmec基因盒基因結(jié)構(gòu)差異有關(guān)[7]。在目前明確的SCCmec分型中，I、Ⅱ、Ⅲ型SCCmec基因盒基因元件結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，特別是存在于該3種SCCmec基因盒上的IS431等插入序列有吸引非β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥基因的作用，能將多種非β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥基因整合到SCCmec基因盒中，使之?dāng)y帶多種耐藥基因并表現(xiàn)為對多種非β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥。多項研究顯示SCCmecI、Ⅱ及Ⅲ型常存在于醫(yī)院獲得性MRSA（hospital aquired MRSA，HA-MRSA）中引起醫(yī)院獲得性感染；SCCmecⅣ型和V型基因盒基因元件比較簡單，不存在吸引其他耐藥基因的元件結(jié)構(gòu)，所以一般不攜帶其他非β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥基因，本研究顯示SCCmecⅣ型菌株為非多重耐藥菌。SCCmecⅣ和V型菌株多存在于社區(qū)獲得MRSA中，由于其可引起暴發(fā)流行和菌株不表現(xiàn)為多重耐藥現(xiàn)在已成為研究的熱點[8]。對于MRSA臨床醫(yī)師經(jīng)驗性治療第一選擇仍為萬古霉素，藥敏結(jié)果顯示MRSA未發(fā)現(xiàn)耐萬古霉素菌株，但由于萬古霉素的廣泛應(yīng)用已出現(xiàn)萬古霉素MIC上升趨勢，使萬古霉素使用受到一定限制，國際上更出現(xiàn)萬古霉素耐藥菌株，為了減緩萬古霉素抗生素壓力防止我國出現(xiàn)萬古霉素耐藥金葡菌，本研究根據(jù)藥物敏感結(jié)果提示攜帶SCCmecⅢ型的醫(yī)院獲得性MRSA株對莫西沙星、氯霉素及米諾環(huán)素耐藥率較低，經(jīng)驗治療時可考慮優(yōu)先選擇使用這些抗生素，而對SCCmecⅣ型菌株對非β-內(nèi)酰胺類的抗菌藥物敏感性較好，經(jīng)驗治療社區(qū)獲得MRSA可以選擇左氧氟沙星、紅霉素及克林霉素等多種抗生素。

由于MRSA的致病性強(qiáng)、傳播速度快和多重耐藥性，其引起的社區(qū)和醫(yī)院感染如果監(jiān)測和控制不當(dāng)，容易引起院內(nèi)或社區(qū)感染的暴發(fā)，嚴(yán)重威脅人類健康。故在醫(yī)院和社區(qū)進(jìn)行MRSA起源、傳播和進(jìn)化、抗菌藥物敏感性試驗的研究監(jiān)測，明確本地區(qū)MRSA流行株和盡早發(fā)現(xiàn)新的MRSA克隆株的播散，可以根據(jù)MRSA菌株起源及傳播特點并獲取耐藥機(jī)制，為制定有針對性的預(yù)防和控制措施提供有力證據(jù)和方法，能有效減少MRSA菌株的傳播和流行。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1]仇廣翠, 孫明忠, 金浩. 220株金黃色葡萄球菌的臨床分布特點及耐藥性分析[J]. 中國實驗診斷學(xué), 2016, 20(2): 269-271.

[2]KUMARI J, SHENOY S M, BALIGA S, et al. Healthcareassociated methicillin-resistant staphylococcus aureus: Clinical characteristics and antibiotic resistance profile with emphasis on macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance[J]. Sultan Qaboos UnⅣ Med J, 2016, 16(2): 175-181.

[3]ZHANG K, MCCLURE J A, ELSAYED S. Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant staphylococcus aureus[J]. J Clin Microbiol,2005, 43(10): 5026-5033.

[4]ENRIGHT M C, ROBINSON A, RANDLE G, et al. The evolutionary history of methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(11): 7687-7692.

[5]FEIL E J, NICKERSON E K, CHANTRATITA N, et al. Rapid detection of the pandemic methicillin-resistant staphylococcus aureus clone st 239, A dominant strain in asian hospitals[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(4): 1520-1522.

[6]楊延成, 程航, 胡珍, 等. 烏魯木齊地區(qū)金黃色葡萄球菌分離株的分子分型與耐藥性分析[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2016, 38(9):1035-1042.

[7]孫麗媛, 武昕媛, 李鈺, 等. ICU耐甲氧西林金黃色葡萄球菌SCCmec基因分型及耐藥性研究[J]. 中國抗生素雜志, 2015,13(10): 468-471.

[8]金春梅, 陳宏斌, 樸美花, 等. 我國延邊地區(qū)金黃色葡萄球菌分子特征研究[J]. 中國感染與化療雜志, 2014, 13(5): 468-471.