蘇秀霞， 張　姣， 欒崇林， 霍文靜，徐　佳

(1.陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 西安　710021; 2.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院, 廣東 深圳　518088)

0　引言

液晶(LCs)兼具液體的流動(dòng)性和固體的光學(xué)各向異性[1]，表面微小的地貌和化學(xué)結(jié)構(gòu)變化即會(huì)引起處于向列相的液晶分子的取向變化[2]，進(jìn)而引起液晶膜顏色和亮度的變化.1998年，Abbot小組[3]首次以液晶作為“敏感元件”，基于構(gòu)建金膜法將基底表面發(fā)生的蛋白質(zhì)結(jié)合事件轉(zhuǎn)換為光學(xué)圖像信號(hào)檢測(cè)抗生物素蛋白(Av)，這種液晶生物傳感技術(shù)具有低耗、快速、無(wú)需標(biāo)記，所呈現(xiàn)的光學(xué)信號(hào)肉眼可觀等優(yōu)點(diǎn)，在非標(biāo)記生物傳感檢測(cè)方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)酪氨酸[4]、膽固醇[5]、多肽[6]、蛋白質(zhì)[7]、核酸[8]、Hg2+[9]等的檢測(cè).

天蠶素B(CB)是人類(lèi)1980年從惜古比天蠶體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)抗菌肽[10]，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌[11]、革蘭氏陰性菌[12]、真菌[13]、癌細(xì)胞[14]、病毒[15]均有抑殺作用，其在動(dòng)植物抗病基因工程[16,17]、植物育種[18]、生物飼料添加劑[19]等領(lǐng)域有著巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值.現(xiàn)有多肽的檢測(cè)方法主要有液相色譜-質(zhì)譜法[20]、毛細(xì)管電泳法[21]和免疫分析法[22]等.然而，以上方法樣品預(yù)處理繁瑣，有的還需要衍生化，對(duì)抗原抗體進(jìn)行標(biāo)記，耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，且對(duì)操作人員要求高，應(yīng)用受限，因此，高靈敏性、特異性、非標(biāo)記、低成本的多肽檢測(cè)方法的研究迫在眉睫.

本文結(jié)合液晶生物傳感器無(wú)需標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，利用競(jìng)爭(zhēng)免疫法，通過(guò)在玻璃基底表面修飾自組裝膜誘導(dǎo)液晶分子垂直均一取向，觀察天蠶素B抗體(anti-CB)與天蠶素B結(jié)合前后液晶膜顏色和亮度的變化，并通過(guò)計(jì)算偏光顯微鏡成像灰度強(qiáng)度定量化分析天蠶素B濃度，構(gòu)建了一種非標(biāo)記、高靈敏、特異性的天蠶素B液晶生物傳感器.

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　試劑與儀器

(1)主要試劑：二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化銨(DMOAP)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、天蠶素B均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；天蠶素B抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；4-氰基-4-戊基聯(lián)苯(5CB)購(gòu)自美國(guó)Instec公司；戊二醛(GA)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為分析純.

(2)主要儀器：XPL3230型透反兩用數(shù)碼偏光顯微鏡(上海光學(xué)儀器一廠)；SPI3800N/SPA400型原子力顯微鏡(日本精工有限公司)；OCA20視頻光學(xué)接觸角(德國(guó)dataphysics公司)；玻片(江蘇飛舟玻塑有限公司)；Mylar聚酯片(廣州市斯朗特電子科技有限公司).

1.2　玻片預(yù)處理

將玻片切割成2 cm×2 cm，用熱的Piranha溶液[V(H2O2)∶V(H2SO4)]=3∶7于80 ℃浸泡1 h，依次用超純水和乙醇清洗干凈，經(jīng)N2吹干，于110 ℃干燥3 h，防塵備用.

1.3　上下玻片的自組裝

上玻片的DMOAP自組裝：將清洗干凈的玻片浸入0.2%(v/v)的DMOAP水溶液中，常溫下靜置半小時(shí)，超純水沖洗干凈，N2吹干，于110 ℃干燥1 h，防塵備用.

下玻片的APTES/DMOAP混合自組裝：將清洗干凈的玻片浸入3%(v/v)APTES和1%(v/v)DMOAP的10 mmol/L的醋酸-醋酸鈉溶液中(pH=5)，于80 ℃恒溫2 h，超純水沖洗干凈，N2吹干，于110 ℃干燥1 h，然后浸入1%(v/v)的GA溶液中37 ℃反應(yīng)1 h，取出后用大量超純水沖洗，N2吹干,防塵備用.

1.4　天蠶素B的固定

將天蠶素B溶解于0.01 mol/L的PBS緩沖液中(pH=7.4)，配置成不同濃度的天蠶素B溶液.取適量的天蠶素B溶液滴加至下玻片表面，于37 ℃反應(yīng)2 h，取出后分別用0.01 mol/L的PBS緩沖液(pH=7.4)和超純水沖洗，除去未固定的天蠶素B分子，N2吹干,置于-20 ℃下冷凍保存.

1.5　液晶池的制作

將處理后的上下玻片面對(duì)面組裝，玻片之間用Mylar聚酯片(中間開(kāi)凸型空腔)隔開(kāi)，除開(kāi)孔方向外，其他三邊用小夾子固定.將液晶5CB于40 ℃恒溫箱中加熱約10 min，使其從渾濁液晶態(tài)變?yōu)槌吻逋噶恋囊簯B(tài)，取少許液晶從開(kāi)孔處利用毛細(xì)管作用力注入液晶池內(nèi)，待液晶布滿(mǎn)整個(gè)空腔，停止加熱，使液晶池緩慢冷卻至室溫(25 ℃)后利用偏光顯微鏡觀察.

1.6　檢測(cè)方法

根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)免疫法，將一定濃度的天蠶素B抗體溶液與不同濃度的待測(cè)天蠶素B抗原溶液于37 ℃恒溫混勻10 min，取適量混合后溶液依次滴加至固定有天蠶素B抗原的玻片上，37 ℃反應(yīng)1 h，抗原抗體即可實(shí)現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)，分別用0.01 mol/L的PBS緩沖液(pH=7.4)和超純水沖洗，除去非特異性吸附物質(zhì)，N2吹干.按照1.5節(jié)方法制備成液晶池，使用偏光顯微鏡觀察液晶膜顏色和亮度變化并采集圖像分析，通過(guò)Adobe Photoshop CS5 軟件計(jì)算偏光顯微鏡成像灰度強(qiáng)度.

2　結(jié)果與討論

2.1　液晶生物傳感器的檢測(cè)原理

本文的檢測(cè)原理如圖1所示，在下玻片表面修飾APTES/DMOAP混合自組裝膜(如圖1(b)所示)，DMOAP用于誘導(dǎo)液晶分子垂直均一取向，APTES中的氨基與GA中的一個(gè)醛基反應(yīng)后作為功能分子固定天蠶素B(如圖1(c)所示).當(dāng)依次滴加一定濃度的天蠶素B抗體溶液與不同濃度的待測(cè)天蠶素B抗原溶液后，此時(shí)玻片上已固定的天蠶素B與待測(cè)天蠶素B競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體上有限的反應(yīng)位點(diǎn)(如圖1(d)所示)，基底固定的天蠶素B與天蠶素B抗體特異性結(jié)合后，由于抗體分子具有一定的空間立體結(jié)構(gòu)以及分子尺寸效應(yīng)，能夠擾亂液晶5CB分子的取向，使其呈傾斜或近平行排列，隨著樣品中待測(cè)天蠶素B濃度的變化，結(jié)合到基底的天蠶素B抗體量也隨之變化，進(jìn)而使液晶膜的顏色和亮度發(fā)生變化(如圖1(e)所示)實(shí)現(xiàn)對(duì)天蠶素B的特異性檢測(cè).當(dāng)不含天蠶素B抗體時(shí)，由于液晶5CB分子呈垂直均一的取向因而不具有雙折射,不能使偏振光透過(guò)，光學(xué)成像為均一黑色圖案(如圖1(f)所示).

2.2基底表面APTES/DMOAP/GA自組裝膜比例優(yōu)化

已有研究表明，基底自組裝膜的化學(xué)結(jié)構(gòu)與液晶膜的有效雙折射(Δneff)直接相關(guān)，進(jìn)而影響其光學(xué)成像[23]，因此液晶生物傳感器的基底修飾對(duì)生物分子的檢測(cè)至關(guān)重要.本文采取APTES與DMOAP混合自組裝法構(gòu)建基底敏感膜，DMOAP中的長(zhǎng)鏈烷基鏈能夠誘導(dǎo)液晶分子沿長(zhǎng)鏈方向取向，呈垂直排列，此時(shí)偏振光不能透過(guò)液晶池，光學(xué)圖像為均一的黑色圖案.APTES中的氨基與GA中的一個(gè)醛基反應(yīng)后作為功能分子固定生物分子，由于APTES為短鏈烷基，不能有效的誘導(dǎo)液晶分子垂直排列，偏光顯微鏡成像會(huì)產(chǎn)生背景干擾，因此，需要探究APTES與DMOAP比例對(duì)液晶取向的影響，確定最優(yōu)比例，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步確定GA最優(yōu)含量.

(a)裸玻片 (b)DMOAP/APTES/GA基底自組裝膜 (c)天蠶素B的固定 (d)天蠶素B抗體與天蠶素B特異性結(jié)合 (e)天蠶素B抗體與天蠶素B特異性結(jié)合后液晶5CB分子為傾斜排列 (f)未加入天蠶素B抗體時(shí)液晶5CB分子為垂直排列圖1　液晶生物傳感器檢測(cè)天蠶素B示意圖及液晶池的組裝過(guò)程

從圖2可以看出，當(dāng)APTES與DMOAP比例較高時(shí)(25∶1，如圖2(a)所示)，由于DMOAP含量較少，不能有效誘導(dǎo)液晶分子垂直排列，光學(xué)成像中亮斑大且多，隨著APTES與DMOAP比例減小，光學(xué)成像中亮斑逐漸減少，當(dāng)兩者比例為5∶1和3∶1時(shí)，光學(xué)成像均為均一黑色圖案，不會(huì)干擾生物分子的檢測(cè)，因此，選取APTES與DMOAP比例為5∶1和3∶1，進(jìn)一步探討GA含量對(duì)液晶取向的影響.

(a)25∶1　　　　　　　(b)10∶1

(c)5∶1　　　　　　　(d)3∶1圖2　不同體積比的APTES/DMOAP基底自組裝膜制備的液晶池光學(xué)成像

GA含量決定基底表面醛基密度，當(dāng)GA含量為2.5%(v/v)時(shí)，APTES與DMOAP比例為5∶1(如圖3(a)所示)和3∶1(如圖3(b)所示)光學(xué)成像中出現(xiàn)均勻分布的較大彩色亮斑.當(dāng)GA含量減少到1%(v/v)時(shí)，圖像中亮斑減少，APTES與DMOAP為5∶1時(shí)(如圖3(c)所示)，亮斑呈星點(diǎn)分布，而當(dāng)兩者比例為3∶1時(shí)(如圖3(d)所示)，圖案呈現(xiàn)全黑背景，不干擾生物分子檢測(cè)，因此實(shí)驗(yàn)最佳比例為APTES與DMOAP體積比為3∶1，GA含量為1%(v/v).

(a)APTES/DMOAP為5∶1,GA含量為2.5%(v/v)　(b)APTES/DMOAP為3∶1,GA含量為2.5%(v/v)　(c)APTES/DMOAP為5∶1,GA含量為1%(v/v)　(d)APTES/DMOAP為3∶1,GA含量為1%(v/v)圖3　GA含量對(duì)液晶池光學(xué)成像的影響

2.3　固定化天蠶素B抗原濃度的優(yōu)化

液晶分子的取向?qū)妆砻娴孛沧兓浅Ｃ舾?，天蠶素B與GA交聯(lián)固定到基底表面后，會(huì)在一定程度上改變表面地貌結(jié)構(gòu)從而影響液晶分子的取向，因此需要考察固定化天蠶素B濃度對(duì)液晶池光學(xué)成像的影響.結(jié)果如圖4所示，當(dāng)天蠶素B濃度較高時(shí)(500 ng/mL)，對(duì)液晶分子取向擾亂程度較大，光學(xué)成像中有較大的彩色亮斑出現(xiàn)(如圖4(a)所示)，背景值較高，干擾后續(xù)檢測(cè).隨著固定化天蠶素B抗原濃度的減小，對(duì)液晶分子取向擾亂減小，液晶池光學(xué)成像逐漸變暗，當(dāng)固定化抗原濃度為150 ng/mL、100 ng/mL、80 ng/mL時(shí)，光學(xué)成像中只有少數(shù)星點(diǎn)亮斑，趨近于全黑背景(如圖4(d)、(e)、(f)所示)，由于需要足夠的抗原與抗體反應(yīng)，因此選擇能夠使光學(xué)成像背景保持黑暗的最高固定化天蠶素B濃度150 ng/mL固定于基底表面.

(a)500 ng/mL　　　　(b)250 ng/mL

(c)200 ng/mL　　　　(d)150 ng/mL

(e)100 ng/mL　　　　(f)80 ng/mL圖4　不同濃度的固定化天蠶素B制備的液晶池光學(xué)成像

2.4　天蠶素B抗體濃度的優(yōu)化

進(jìn)一步考察天蠶素B抗體濃度對(duì)液晶池光學(xué)成像的影響.如圖5所示，在樣品中不含待測(cè)天蠶素B抗原的條件下，天蠶素B抗體濃度為1 000、500 ng/mL時(shí)(如圖5(a)、(b)所示)，偏光顯微鏡成像中有彩色亮斑出現(xiàn)，當(dāng)天蠶素B抗體濃度為300、150、75 ng/mL時(shí)，偏光顯微鏡成像只有少數(shù)亮點(diǎn)趨近于全黑背景(如圖5(c)、(d)、(e)所示).在后續(xù)檢測(cè)中，基底已固定天蠶素B會(huì)與待測(cè)天蠶素B競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合天蠶素B抗體上有限的反應(yīng)位點(diǎn)，當(dāng)待測(cè)天蠶素B濃度趨于0時(shí)(檢測(cè)限無(wú)限低)，天蠶素B抗體最大限度地與基底已固定天蠶素B結(jié)合擾亂液晶分子取向，使液晶池光學(xué)成像產(chǎn)生亮斑.隨著待測(cè)天蠶素B濃度的增加，與基底已固定天蠶素B結(jié)合的天蠶素B抗體隨之減小，光學(xué)成像由亮變暗，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)天蠶素B的檢測(cè).由于樣品中待測(cè)天蠶素B含量較低，基于競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)變化非常小，較大濃度的天蠶素B抗體會(huì)影響檢測(cè)限，因此選擇能夠使光學(xué)成像出現(xiàn)亮斑的最低天蠶素B抗體濃度500 ng/mL進(jìn)行后續(xù)檢測(cè).

(a)1 000 ng/mL　　　　　(b)500 ng/mL

(c)300 ng/mL　　　　　　(d)150 ng/mL

(e)75 ng/mL圖5　不同濃度的天蠶素B抗體制備的液晶池光學(xué)成像

2.5　天蠶素B的檢測(cè)

基于競(jìng)爭(zhēng)免疫原理，在一定濃度范圍內(nèi)，待測(cè)天蠶素B的濃度越低，結(jié)合到基底玻片表面的天蠶素B抗體分子越多，圖像越亮；反之，待測(cè)天蠶素B濃度越高，結(jié)合到基底玻片表面的天蠶素B抗體分子越少，圖像趨于全黑.如圖6所示，當(dāng)待測(cè)天蠶素B含量超過(guò)0.1 ng/mL時(shí)，光學(xué)信號(hào)出現(xiàn)明顯變化.

(a)0 ng/mL　　　　(b)0.01 ng/mL

(c)0.1 ng/mL　　　(d)1 ng/mL

(e)10 ng/mL　　　　(f)100 ng/mL圖6　不同濃度的待測(cè)天蠶素B制備的液晶池光學(xué)成像

2.6　天蠶素B濃度定量分析

以上方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)天蠶素B的定性檢測(cè).為了進(jìn)一步定量化檢測(cè)天蠶素B濃度，探究了圖6中偏光顯微鏡成像灰度強(qiáng)度值與天蠶素濃度之間的相關(guān)性.如圖7所示，隨著天蠶素B濃度的增加，偏光顯微鏡成像灰度值逐漸減小，當(dāng)天蠶素B濃度大于10 ng/mL時(shí)，灰度強(qiáng)度值趨于0.天蠶素B濃度在0.01～0.1 ng/mL范圍內(nèi)時(shí)，偏光顯微鏡成像灰度強(qiáng)度值與天蠶素B濃度之間具有線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.985 2.液晶生物傳感器傳感器能夠使天蠶素B的檢測(cè)限低至0.01 ng/mL.

圖7　偏光顯微鏡成像灰度強(qiáng)度與天蠶素B濃度關(guān)系(插圖：天蠶素B濃度在0.01～0.1 ng/mL范圍內(nèi)與偏光顯微鏡灰度強(qiáng)度之間為線性關(guān)系.誤差線為每個(gè)濃度進(jìn)行四次測(cè)量后的標(biāo)準(zhǔn)偏差.)

3　結(jié)論

(1) 硅烷化試劑自組裝膜法構(gòu)建的基底敏感膜能夠很好的誘導(dǎo)液晶分子垂直取向，偏光顯微鏡觀測(cè)結(jié)果表明：APTES與DMOAP體積比為3∶1，GA含量為1%時(shí)(v/v)，光學(xué)成像為均一黑色圖案，不干擾后續(xù)檢測(cè).

(2) 基于競(jìng)爭(zhēng)免疫原理，固定化天蠶素B濃度為150 ng/mL時(shí)光學(xué)成像為黑色圖案，天蠶素B抗體濃度為500 ng/mL時(shí)，光學(xué)成像中有彩色亮斑出現(xiàn)，以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步檢測(cè)待測(cè)天蠶素B.

(3) 液晶生物傳感器可在0.01～0.1 ng/mL線性范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)天蠶素B的非標(biāo)記、高靈敏性、特異性檢測(cè)，檢測(cè)低至0.01 ng/mL.

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