劉莉，楊永姣，龍安安，Jhamb Sunidhi，Aravind.D，劉曉強(qiáng)

(1天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津300211；2天津市泌尿外科研究所；3天津醫(yī)科大學(xué)國際醫(yī)學(xué)院)

腫瘤標(biāo)記物可以用來特異性檢測某種惡性疾病，臨床上常應(yīng)用腫瘤標(biāo)記物來診斷特定腫瘤。許多膀胱腫瘤標(biāo)記物已經(jīng)FDA認(rèn)可應(yīng)用于臨床檢測[1]，但到目前仍然缺少一種敏感且特異的腫瘤標(biāo)記物來取代現(xiàn)有有創(chuàng)的膀胱鏡以及低敏感度的尿細(xì)胞學(xué)的檢測方法。本研究通過ELISA方法檢測膀胱癌患者尿中核基質(zhì)蛋白22(NMP22)、細(xì)胞黏附分子44(CD44)、細(xì)胞角蛋白20(CK20)、癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子1(CEACAM1)、膀胱腫瘤抗原(BTA)的表達(dá)情況，并探討這5種標(biāo)記物聯(lián)合檢測對膀胱癌的診斷價值。

1　資料與方法

1.1　臨床資料

選擇2015年12月～2016年6月因考慮膀胱腫瘤就診于天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院的患者84例。所有患者均有完整的病例資料且近期未接受泌尿生殖系統(tǒng)操作以及手術(shù)、放化療等。其中64例經(jīng)膀胱鏡檢或經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)行病理檢查證實(shí)為膀胱尿路上皮癌患者(腫瘤組)，男41例、女23例，年齡(66.4±9.8)歲，TNM分期Ta期10例、T1期47例、T2期7例。依據(jù)最新的膀胱癌分級方法，低級別尿路上皮腫瘤20例，高級別尿路上皮腫瘤44例。另外20例診斷為其他非惡性腫瘤性泌尿系統(tǒng)疾病(對照組)，男10例、女10例，年齡(65.8±8.0)歲。其中前列腺增生7例，泌尿系統(tǒng)感染7例，泌尿系統(tǒng)結(jié)石4例，膀胱良性腫瘤2例。

1.2　尿NMP22、CD44、CK20、CEACAM1、BTA檢測

患者入院后，在行導(dǎo)尿、膀胱鏡檢查術(shù)、直腸指診等泌尿系相關(guān)操作之前，留取新鮮的清晨清潔中段尿50～100 mL，離心取上清，-20 ℃保存，用于檢測NMP22、CD44、CK20、CEACAM1、BTA。采用ELISA方法，按照ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)操作步驟進(jìn)行檢測，最后使用波長450 nm的酶標(biāo)儀測定并計(jì)算樣本中各腫瘤標(biāo)記物水平。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　兩組尿NMP22、CD44、CK20、CEACAM1、BTA水平比較

見表1。腫瘤組尿NMP22、CD44、CK20、CEACAM1、BTA水平均高于對照組(P均<0.05)。

表1　兩組尿NMP22、CD44、CK20、CEACAM1、BTA水平比較

注：與對照組比較，*P<0.01。

2.2　各腫瘤標(biāo)記物檢測膀胱癌的敏感度及特異度

見表2。NMP22檢測膀胱癌的敏感度最高(84.3%)，但特異度僅為55.0%。結(jié)合AUC比較，CD44的檢測價值最大，當(dāng)CD44取臨界值為348.8 pg/mL時，敏感度為82.8%，特異度為85.0%。

表2　各腫瘤標(biāo)記物的敏感度和特異度(%)

2.3　不同病理分期患者尿中各腫瘤標(biāo)記物的敏感度比較

見表3。CEACAM1對高分期膀胱癌的診斷敏感度高于低分期(P均<0.05)。其他4種腫瘤標(biāo)記物對不同分期膀胱癌診斷的敏感度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。

表3　　　　不同病理分期患者尿中各腫瘤標(biāo)記物的敏感度比較(%)

注：與Ta期比較，*P<0.05。

2.4　不同病理分級患者尿中各腫瘤標(biāo)記物的敏感度比較

見表4。5種腫瘤標(biāo)記物對不同分級膀胱癌診斷的敏感度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。

表4　　　　不同病理分級患者尿中各腫瘤標(biāo)記物的敏感度比較(%)

2.5　5種標(biāo)記物組合聯(lián)合檢測膀胱癌比較

見表5。NMP22、CD44、CK20、CEACAM1、BTA聯(lián)合檢測診斷膀胱癌的敏感度達(dá)98.4%，但特異度卻降低為35.0%。CD44、CK20、BTA聯(lián)合檢測具有較高的敏感度和特異度，其AUC為0.905(95%CI為0.822～0.958)，診斷效能高于其他組合的診斷效能。

表5　　　　5種腫瘤標(biāo)記物不同組合聯(lián)合檢測的敏感度及特異度(%)

3　討論

世界各地每年發(fā)生約38萬例膀胱癌[1]，而且大部分膀胱癌在初次診斷時為非肌層浸潤性(NMIBC)[2]。在NMIBC中，約70%的病例表現(xiàn)為pTa，20%為pT1，10%為CIS病變[3]。通常診斷為NMIBC的患者預(yù)后良好，但仍有30%～80%的癌癥復(fù)發(fā)，并且10%～15%的患者將在5年內(nèi)進(jìn)展到肌肉侵襲[4]。膀胱癌的特點(diǎn)是高復(fù)發(fā)率，特別是腫瘤直徑>3 cm，多發(fā)、高級別的膀胱癌，屬于高復(fù)發(fā)風(fēng)險的患者，因此早發(fā)現(xiàn)和積極的隨訪對膀胱癌患者極為重要。膀胱鏡檢查術(shù)以及尿細(xì)胞學(xué)檢查是臨床用來診斷以及膀胱癌隨訪的主要方法，但仍然存在膀胱癌漏診的發(fā)生，特別是對于早期低級別、低分期的膀胱癌，同時有創(chuàng)的膀胱鏡以及低敏感度的尿細(xì)胞學(xué)這兩項(xiàng)檢測本身的缺點(diǎn)也造成無法滿足日常臨床需求。這些問題使得一種新的檢測手段成為需求。腫瘤標(biāo)記物可以用來診斷特定腫瘤，并對腫瘤的治療及預(yù)后進(jìn)行評估，許多腫瘤標(biāo)記物試劑盒已經(jīng)FDA認(rèn)可應(yīng)用于臨床檢測[5]，但目前仍然缺少一種敏感且特異的腫瘤標(biāo)記物來取代現(xiàn)有有創(chuàng)的膀胱鏡以及低敏感度的尿細(xì)胞學(xué)檢測方法。本研究通過ELISA法檢測NMP22、CD44、CK20、CEACAM1、BTA 5種腫瘤標(biāo)記物在膀胱癌患者尿液中的表達(dá)情況，并探討5種腫瘤標(biāo)記物聯(lián)合檢測用于診斷膀胱癌的可行性，結(jié)果顯示，5種腫瘤標(biāo)記物在腫瘤組的表達(dá)水平均高于對照組，應(yīng)用ELISA法檢測尿中這5種腫瘤標(biāo)記物對膀胱癌的診斷具有重要意義。

Carpinto等[6]發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者尿中NMP22水平高于正常對照組，有臨床表現(xiàn)的膀胱癌患者的尿NMP22水平高于沒有臨床表現(xiàn)的膀胱癌患者。Zippen等[7]報(bào)道，當(dāng)NMP22的臨界值取10.0 U/mL時，NMP22的敏感度達(dá)100%，特異度達(dá)85%，而尿細(xì)胞學(xué)檢測的敏感度卻很低，僅為33%；并且尿液中NMP22水平不會隨著腫瘤的分期、分級而發(fā)生明顯變化。本研究結(jié)果顯示，腫瘤組NMP22水平高于對照組。依據(jù)NMP22不同水平繪制ROC曲線，發(fā)現(xiàn)當(dāng)NMP22取臨界值為1.125 ng/mL時，敏感度為84.3%，特異度為55.0%?？紤]為對照組存在其他非惡性腫瘤性泌尿系統(tǒng)疾病的干擾，使對照組NMP22結(jié)果上升導(dǎo)致。同時，比較膀胱癌組不同分期、分級患者NMP22水平時發(fā)現(xiàn)，雖然NMP22隨著膀胱癌臨床分期的升高，其敏感度有升高的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Miyanag等[8]研究證實(shí)，BTA檢測膀胱癌的敏感度顯著高于尿細(xì)胞學(xué)檢測的敏感度，尤其是對于體積小的、孤立的、淺表腫瘤，BTA的敏感度比尿細(xì)胞學(xué)高得多。deVeve White等[9]也發(fā)現(xiàn)，BTA檢測膀胱癌的敏感度大于尿細(xì)胞學(xué)檢查，并且BTA在正常志愿者中的特異度為95.5%。本研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組BTA水平高于對照組。與尿細(xì)胞學(xué)對比，BTA敏感度更高，但特異度也更低。同時，比較膀胱癌組不同分期、分級患者BTA水平時發(fā)現(xiàn)，BTA水平的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

CK20是成熟腸細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的主要細(xì)胞蛋白，特異性地存在于胃腸黏膜中。在一些腺癌的上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CK20蛋白的存在，例如結(jié)腸直腸癌、尿路上皮細(xì)胞癌和默克爾細(xì)胞癌，但在肺癌和非黏液性卵巢癌中不存在。利用這個特點(diǎn)，CK20可以作為一類理想的上皮性腫瘤的標(biāo)記物[10]。Buchumensky等[11]采用RT-PCR方法測定尿液中CK20的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CK20對膀胱癌的診斷陽性率達(dá)91%，明顯高于尿細(xì)胞學(xué)；在健康志愿組中，CK20全部陰性，其特異度高達(dá)100%。本研究結(jié)果顯示，腫瘤組CK20水平高于對照組；CK20檢測膀胱癌的敏感度為76.6%，特異度為85.0%；比較膀胱癌組不同分期、分級患者CK20檢測膀胱癌的敏感度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常人的尿路上皮中CD44少量表達(dá)，當(dāng)尿路上皮發(fā)生早期惡變時，CD44水平會逐漸增加，之后又隨著腫瘤發(fā)展侵襲，CD44表達(dá)又逐漸減少[12]。Woodman等[13]采用ELISA試劑檢測尿液中CD44水平，發(fā)現(xiàn)膀胱腫瘤患者尿液中CD44水平高于健康志愿組，其敏感性可達(dá)到81.1%，而特異性接近100%。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌組CD44水平高于對照組。依據(jù)CD44的ROC曲線，當(dāng)CD44取臨界值為348.8 ng/mL時，AUC為0.859，與其他標(biāo)記物比較CD44的AUC最大，說明在單一腫瘤標(biāo)記物中，CD44檢測診斷膀胱癌的準(zhǔn)確性最高。

Tilki等[14]比較膀胱癌患者和非腫瘤的對照受試者尿標(biāo)本中的CEACAM1水平，發(fā)現(xiàn)在健康志愿者、NMIBC以及MIBC患者尿中CEACAM1的檢出率分別為0、76%、100%。研究者還發(fā)現(xiàn)，CEACAM1水平隨著膀胱癌的分期、分級增加而增高。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌組CEACAM1水平高于對照組，CEACAM1檢測膀胱癌的敏感度為68.8%，特異度為75.0%；CEACAM1檢測膀胱癌的敏感度隨著膀胱癌分期升高而增加，而對不同分級膀胱癌的診斷敏感度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

目前,仍缺乏一種標(biāo)記物可以達(dá)到較高的敏感度和特異度來檢測膀胱癌。腫瘤標(biāo)記物的聯(lián)合可以彌補(bǔ)單一標(biāo)記物的缺陷，能夠得到更高的特異度以及敏感度。李揚(yáng)等[15]將NMP22、UBC、BTA聯(lián)合來對膀胱癌進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)3種標(biāo)記物聯(lián)合的總陽性率為96.9%，特異度為80.0%，優(yōu)于單一腫瘤標(biāo)記物。孫羿等[16]對BTA、NMP22、透明質(zhì)酸(HA)、生存蛋白、CD44、VEGF和VUC 7種腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行兩項(xiàng)聯(lián)合檢測，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測敏感度最高的是NMP22+HA和HA+CD44。本研究選用了目前被公認(rèn)有診斷價值的5項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物來檢測膀胱癌，發(fā)現(xiàn)當(dāng)5項(xiàng)腫瘤標(biāo)記物聯(lián)合檢測時，敏感度為98.4%，但特異度卻降至35.0%。不同標(biāo)記物組合比較，CD44、CK20、BTA 3種標(biāo)記物組合具有較高的敏感度和特異度，在保證特異度達(dá)到80.0%的情況下，敏感度達(dá)到96.8%；ROC曲線分析可見，3者聯(lián)合檢測的診斷效能高于其他組合。另外，考慮到經(jīng)濟(jì)效益，當(dāng)CD44與CK20聯(lián)合時，敏感度為93.7%，特異度為80.0%，在保持較高敏感度以及特異度的前提下，二者聯(lián)合花費(fèi)更少。后續(xù)的臨床應(yīng)用需要結(jié)合腫瘤標(biāo)記物聯(lián)合檢測的效能、花費(fèi)和臨床實(shí)踐綜合決策選擇最佳方案。

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