岳　穎，周　珺，賈正平，李茂星，張汝學(xué)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)作為一種的慢性代謝疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。糖代謝異常是其主要發(fā)病特點(diǎn)，其中以肝臟過度生成葡萄糖和糖原儲存減少致使血糖升高為主要病因。肝臟胰島素抵抗(insulin resistance, IR)表現(xiàn)為肝糖代謝平衡紊亂，涉及糖酵解、糖異生以及肝糖原的合成和分解等多個途徑的異常，而肝糖代謝的關(guān)鍵酶葡萄糖激酶(glucokinase, GK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxylase kinase, PEPCK)、葡糖糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase, G-6-P)、糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3, GSK-3β)均參與其中并發(fā)揮重要作用[1]。近年來研究認(rèn)為，T2DM的IR、糖脂代謝異常等都與線粒體功能障礙具有重要關(guān)系[2-3]。線粒體融合蛋白2(mitofusin2, Mfn2)參與線粒體的融合，與線粒體的結(jié)構(gòu)形態(tài)及功能調(diào)節(jié)變化有著不可分割的聯(lián)系，可以介導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞能量代謝、信號傳導(dǎo)等。T2DM狀態(tài)下，肝臟內(nèi)Mfn2的缺失及表達(dá)下降使得肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)形態(tài)和功能異常，發(fā)生肝臟IR，導(dǎo)致肝糖代謝失衡[4-5]。因此，基于Mfn2介導(dǎo)的肝臟糖代謝變化可作為新型的糖尿病治療靶點(diǎn)。褪黑素對線粒體功能和機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)的維持以及T2DM導(dǎo)致的IR等都具有調(diào)節(jié)作用[6]。Neu-p11是一種新型褪黑素受體激動劑，相較褪黑素具有半衰期更長，選擇性更高，不良反應(yīng)少，易合成的優(yōu)勢[7]。本實(shí)驗(yàn)通過建立T2DM大鼠模型，研究褪黑素及Neu-p11不同給藥劑量對Mfn2介導(dǎo)的T2DM大鼠血糖、胰島素、IR和肝糖代謝酶mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用以及對肝臟的保護(hù)作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物SPF級雌性Wistar大鼠50只，體重160～180 g，由蘭州大學(xué)提供，動物合格證號：62000800000144，許可證號：SCXK(甘)2013-0002。飼養(yǎng)于蘭州總醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)科，定量攝食進(jìn)水，室溫18～25℃。

1.2主要藥品與試劑檸檬酸(20100304，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；檸檬酸三鈉(20090826，萊陽市雙雙化工有限公司)；血糖測定試劑盒(163561，中生北控生物科技股份有限公司)；50%葡萄糖注射液(C1506145，湖南科倫制藥有限公司)；4%多聚甲醛(Cat#P1110，Solarbio公司)；胰島素放射免疫分析藥盒(S10950186，天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司)；Primescript RT Master Mix、TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、TaKaRa SYBR Premix Ex Taq(RR036A、9767、RR802A，TakaRa公司)；高脂飼料(基礎(chǔ)飼料40%、雞蛋34%、豬油20%、白砂糖5.1%、熱量為22.1 kJ/g、糖類熱量25%、脂肪熱量60.17%，蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)科)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器BP210S電子天平購自賽多利斯有限公司；PHS-3B型pH計(jì)購自雷磁儀器公司；HP-8453紫外分光光度計(jì)購自美國惠普公司；SpectraMax i3全自動熒光酶標(biāo)儀購自美國Molecular公司；Vitalab ISP-21半自動生化分析儀購自荷蘭Vital Scientific公司；Sigma 3K15低溫離心機(jī)購自德國Sigma公司；IEC-Micromax離心機(jī)購自美國ThermoElectron公司；MG96G Long Gene PCR儀購自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；AB ViiA7 Realtime PCR購自美國Applied Biosystems公司。

1.4T2DM大鼠模型的建立、分組及給藥雌性Wistar大鼠50只在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)10 d后，隨機(jī)抽取10只作為正常對照組，剩余40只進(jìn)行造模。正常對照組給予常規(guī)飼料飼養(yǎng)，造模大鼠均給予高脂飼料飼養(yǎng)，期間自由飲水。2個月后，造模大鼠空腹16 h，按體重腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg，7 d后測定空腹血糖，根據(jù)大鼠血糖狀態(tài)未達(dá)標(biāo)者再次注射STZ 15 mg/kg，7 d后測定空腹血糖，血糖>13.0 mmol/L的大鼠為造模成功，按照血糖和體重均分為糖尿病模型組,褪黑素組,Neu-p11低、高劑量組，每組9只。正常對照組與模型組給予等量水，褪黑素組給予褪黑素10 mg/kg，Neu-p11低、高劑量組分別給予Neu-p11 5 mg/kg、10 mg/kg；灌胃體積為1 ml/200 g，每天8:30給藥,連續(xù)給藥4周。

1.5相關(guān)指標(biāo)測定①空腹血糖(FBG)：給藥前、給藥1、2、3、4周，各組大鼠禁食不禁水6 h后，用乙醚麻醉，眼球后靜脈叢取血，6000 r/min離心4 min，取血清，用葡萄糖氧化酶法測定FBG。②腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)(IPGTT)：給藥21 d，大鼠禁食不禁水6 h后，根據(jù)大鼠體重按1 ml/200 g腹腔注射50%葡萄糖溶液，分別在注射前、注射后30、60和120 min，乙醚麻醉大鼠，取眼球后靜脈叢血，置于含抗凝劑肝素鈉(50 U/ml)的EP管中，6000 r/min離心4 min；用葡萄糖氧化酶法測定4個時(shí)間點(diǎn)的血糖值。③空腹胰島素(INS)、IR指數(shù)(HOMA-IR)和胰島素敏感指數(shù)(ISI)：給藥4周，采用放射免疫法測定血清INS，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行操作；并計(jì)算HOME-IR和ISI，具體公式如下：HOMA-IR=FBG(mmol/L)×INS(mU/L)/22.5、ISI=Ln1/[FBG(mmol/L)×INS(mU/L)]。

1.6大鼠肝臟組織相關(guān)基因表達(dá)的測定大鼠處死后，剖取大鼠肝臟組織，稱取約20 mg，加Buffer RL試劑600 ml研磨勻漿，提取肝臟組織中的總RNA。將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件：37℃，15 min；85℃，5 s；-20℃保存。根據(jù)Mfn2、GK、PEPCK、G-6-P、GSK-3的基因序列設(shè)計(jì)引物，見表1。RT-PCR反應(yīng)條件：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，31 s；共40個循環(huán)；-20℃保存。每批模板均同時(shí)進(jìn)行內(nèi)參β-actin和目的基因的擴(kuò)增反應(yīng)。獲得數(shù)據(jù)以RQ=2-ΔΔCT計(jì)算mRNA表達(dá)量。

1.7大鼠肝臟病理切片的制作及觀察將大鼠用水合氯醛麻醉后固定在取材板上，打開胸腔，將心臟露出，灌注后取出大鼠肝臟，應(yīng)用4%多聚甲醛固定；而后將肝臟切成厚度為2 mm的組織塊，梯度乙醇和二甲苯脫水，再浸于60℃的固體石蠟中，重復(fù)2次。然后石蠟包埋、切片，再將切片置于60℃烤箱中4 h，保存于切片盒中；最后進(jìn)行HE染色觀察。

2　結(jié)果

2.1大鼠FBG水平比較4組T2DM大鼠不同時(shí)間點(diǎn)FBG水平均顯著高于正常對照組(P<0.01)。與模型組比較，褪黑素組不同時(shí)間點(diǎn)FBG水平差異不顯著，Neu-p11低、高劑量組給藥1、2、3周FBG水平具有降低趨勢，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給藥4周后，Neu-p11低劑量組FBG水平低于模型組(P<0.05)。見表2。

表1　大鼠肝臟組織相關(guān)基因的引物序列

注：GK為葡萄糖激酶，PEPCK為磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶，G-6-P為葡糖糖-6-磷酸酶，GSK-3β為糖原合成激酶-3β，Mfn2為線粒體融合蛋白2

2.2大鼠IPGTT結(jié)果比較腹腔注射葡萄糖30 min后，各組血糖水平達(dá)到峰值。4組T2DM大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血糖水平顯著高于正常對照組(P<0.01)。給藥組血糖值上升幅度相較其他組較小，其中褪黑素最優(yōu)；注射后60和120 min，Neu-p11低劑量組較模型組血糖水平有明顯下降趨勢，Neu-p11高劑量與褪黑素組較模型組血糖水平變化不明顯，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2　5組大鼠空腹血糖水平比較

注：與正常對照組比較，bP<0.01；與模型組比較，aP<0.05

表3　5組大鼠腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)結(jié)果比較

注：與正常對照組比較，bP<0.01

2.3大鼠INS、HOMA-IR和ISI水平比較4組T2DM大鼠INS和HOMA-IR水平高于正常對照組，ISI水平低于正常對照組(P<0.01)。Neu-p11低劑量組INS和HOMA-IR水平低于模型組(P<0.05)，但褪黑素組、Neu-p11低、高劑量組ISI水平改善效果不明顯(P>0.05)。見表4。

2.4大鼠肝臟Mfn2和糖代謝關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)情況4組T2DM大鼠PEPCK、G-6-P、GK、GSK-3β和Mfn2 mRNA表達(dá)水平與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。褪黑素組、Neu-p11低、高劑量組Mfn2 mRNA表達(dá)水平以及Neu-p11低劑量組GK mRNA表達(dá)水平均高于模型組(P<0.05，P<0.01)。褪黑素組、Neu-p11低、高劑量組G-6-P mRNA表達(dá)水平以及Neu-p11低、高劑量組PEPCK mRNA表達(dá)水平均低于模型組(P<0.05，P<0.01)。見表5。

表4　5組大鼠INS、HOMA-IR和ISI水平比較

注：INS為空腹胰島素，HOMA-IR為胰島素抵抗指數(shù)，ISI為胰島素敏感指數(shù)；與正常對照組比較，bP<0.01；與模型組比較，aP<0.05

表5　5組大鼠肝臟Mfn2和糖代謝關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)情況

注：GK為葡萄糖激酶，PEPCK為磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶，G-6-P為葡糖糖-6-磷酸酶，GSK-3β為糖原合成激酶-3β，Mfn2為線粒體融合蛋白2；與正常對照組比較，bP<0.01；與模型組比較，aP<0.05，dP<0.01

2.5大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)變化正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞成多邊形，細(xì)胞核大而圓，核仁清晰，核周邊間隙均勻，細(xì)胞索排列規(guī)律整齊。模型組的肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞核排列不規(guī)律，大部分肝細(xì)胞呈現(xiàn)大泡狀，胞漿透明且疏松。褪黑素組、Neu-p11低、高劑量組相較于模型組細(xì)胞索排列緊密整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，其中Neu-p11低量組對肝組織形態(tài)改善明顯，細(xì)胞核色深，核仁清晰，基本無大泡狀細(xì)胞，褪黑素組和Neu-p11高劑量組出現(xiàn)少量大泡狀細(xì)胞，肝組織整體形態(tài)良好。見圖1。

圖1　5組大鼠肝臟組織HE染色病理切片(HE ×200) A.正常對照組；B.模型組；C.褪黑素組；D.Neu-p11低劑量組；E.Neu-p11高劑量組

3　討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能障礙是T2DM發(fā)生IR和代謝失衡的重要原因[7]。線粒體作為一個獨(dú)立、自主的動態(tài)細(xì)胞器，其形態(tài)、數(shù)量與功能有著緊密聯(lián)系，線粒體通過不斷融合和斷裂以維持其在細(xì)胞內(nèi)數(shù)量和形態(tài)的變化。Mfn2是誘導(dǎo)線粒體融合的主要蛋白，在線粒體融合時(shí)起到外膜融合內(nèi)膜?？康淖饔茫瑢€粒體結(jié)構(gòu)形態(tài)和功能調(diào)節(jié)維持有重要意義[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，T2DM可造成Mfn2的表達(dá)低下，線粒體融合分裂失衡，數(shù)量與形態(tài)異常，線粒體功能障礙，形成IR[8]。肝臟作為胰島素和血糖調(diào)節(jié)的敏感器官，在糖代謝調(diào)節(jié)中占有重要地位。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，胰島組織受損導(dǎo)致的高血糖，促使肝臟內(nèi)Mfn2表達(dá)低下，線粒體形態(tài)和數(shù)量變化紊亂影響糖酵解、糖異生和肝糖原的合成分解等途徑，導(dǎo)致肝臟IR，誘發(fā)肝糖代謝關(guān)鍵酶表達(dá)異常。

褪黑素作為一種具有晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)激素，對機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、線粒體形態(tài)和功能的改善有較好效果[10]。褪黑素影響碳水化合物代謝的平衡，可通過減少糖異生和促進(jìn)糖酵解來維持糖代謝的穩(wěn)態(tài)[11]。內(nèi)源性褪黑素失衡可導(dǎo)致大鼠糖耐量異常和IR，同時(shí)也導(dǎo)致動物體內(nèi)肝臟和骨骼肌糖原合成的減少[12]。褪黑素半衰期短、容易快速代謝、藥效短、不穩(wěn)定，Neu-p11作為新合成的褪黑素受體激動劑具有半衰期長、選擇性高、易合成等特點(diǎn)，有望成為治療糖尿病的藥物[13]。本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料長期喂養(yǎng)大鼠加小劑量注射STZ成功誘發(fā)T2DM模型，呈現(xiàn)空腹血糖顯著上升，葡萄糖耐量下降及IR等特點(diǎn)[14]。給予褪黑素和Neu-p11治療后，褪黑素組和Neu-p11低劑量組可顯著改善T2DM大鼠的IR，且Neu-p11低劑量組對T2DM大鼠具有長效降糖作用，對葡萄糖耐受能力也有較好改善。

T2DM狀態(tài)下，大鼠肝臟內(nèi)過度產(chǎn)生葡萄糖，減少肝糖原儲存，其原因?yàn)镮R導(dǎo)致肝臟代謝基因的表達(dá)紊亂。其中GK表達(dá)降低，致使肝臟糖酵解減弱，糖原合成減少；而PEPCK、G-6-P、GSK-3β表達(dá)被激活，糖異生增強(qiáng)，血液中葡萄糖含量升高[1，15]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，高血糖及IR患者肝臟的線粒體結(jié)構(gòu)紊亂腫脹，基質(zhì)密度降低，線粒體融合分裂蛋白基因表達(dá)異常，尤其是Mfn2基因表達(dá)顯著降低[16-18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，長期給予T2DM大鼠Neu-p11，可激活Mfn2的基因表達(dá)，改善Mfn2 mRNA在T2DM大鼠肝臟內(nèi)的低表達(dá)狀態(tài)，維持肝臟線粒體的正常形態(tài)和功能，改善IR，增強(qiáng)肝臟胰島素的敏感性[19]；調(diào)節(jié)肝糖代謝糖異生、糖酵解等重要途徑關(guān)鍵酶mRNA的表達(dá)，上調(diào)GK mRNA的表達(dá)，增強(qiáng)糖酵解，加速肝糖原的生成，減少血液中的葡萄糖；下調(diào)PEPCK、G-6-P mRNA的表達(dá)，抑制糖異生和糖原分解，對肝糖代謝紊亂起到緩解和治療的效果。

高脂飲食誘發(fā)的T2DM大鼠，肝細(xì)胞會呈現(xiàn)腫脹狀態(tài)，細(xì)胞體積增大，易發(fā)生脂肪變性和炎性細(xì)胞浸潤。肝臟HE染色顯示，褪黑素組、Neu-p11低、高劑量組明顯改善了T2DM大鼠肝臟的組織形態(tài)，肝臟細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積少，細(xì)胞索排列緊密，空泡減少，Neu-p11低劑量組改善效果顯著。

綜上所述，褪黑素與Neu-p11可通過介導(dǎo)T2DM大鼠肝臟Mfn2 mRNA表達(dá)來參與改善IR，影響肝糖代謝關(guān)鍵酶mRNA的表達(dá)，改善T2DM大鼠肝臟的組織形態(tài)，調(diào)節(jié)T2DM大鼠的糖代謝異常。這對后期褪黑素及其受體激動劑基于線粒體功能平衡治療T2DM及IR的機(jī)制研究具有指導(dǎo)意義。

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