楊　雁，劉行仁，蔣才玉，吳　池，鄒　俊

隨著新藥和靶向治療的進展，肺癌的治療方式也趨于多元化，使其5年生存率得到顯著的提高[1-2]。盡管如此，由于缺乏對肺癌早期篩查的有效手段，以及缺少預(yù)測肺癌危險因素的分子標(biāo)記物，其治療效果始終沒有達(dá)到預(yù)期的標(biāo)準(zhǔn)[3]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，miR-29家族在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)行為中發(fā)揮作用[4]。miR-29的家族成員的在白血病、黑色素瘤、肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌和肺癌中都表現(xiàn)出低表達(dá)[5-10]。Fabbri等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-29的家族成員能靶向調(diào)控DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A和3B，這兩種酶在DNA甲基化的過程中起到至關(guān)重要的作用，而且與肺癌患者的生存也有一定聯(lián)系。miR-29的重新表達(dá)能使肺癌細(xì)胞恢復(fù)正常的DNA甲基化模式，也使得再沉默甲基化的腫瘤抑制基因(如FHIT和WWOX)重新表達(dá)，最終達(dá)到抑制腫瘤生成的目的。Rothschild等[12]證實了miR-29b參與Src-ID1信號傳導(dǎo)通路，起到減弱肺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的目的。因此，基于miRNA的靶向治療模式，miR-29b成為了一位極具競爭力的候選者。髓細(xì)胞白血病因子-1(myeloid cell leukemia-1, Mcl-1)蛋白是一種多區(qū)的抗凋亡蛋白，屬于B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)蛋白家族的一員，在肺癌中起到了重要的促癌效應(yīng)，但其上游的調(diào)控因子卻無法明確[13]。本研究的目的在于探究miR-29b在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況以及與Mcl-1相互作用關(guān)系，并分析其對肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1　材料與方法

1.1組織樣本收集2016年10月—2017年3月在四川省人民醫(yī)院進行肺癌切除術(shù)患者的腫瘤組織和癌旁正常組織18例，病理類型均為非小細(xì)胞肺癌。所有患者術(shù)前均未接受其他治療。其中男14例，女4例；年齡51～72歲，中位年齡61歲。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)同意。取出的腫瘤組織和癌旁正常組織樣本立即經(jīng)液氮冷凍并儲存在-80℃冰箱待測。

1.2細(xì)胞株和實驗試劑人非小細(xì)胞肺癌株SPC-A1由武漢細(xì)胞生物研究所提供。RPMI-1640培養(yǎng)液、10%小牛血清、100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素、0.25%胰酶溶液購自Gibco公司，二甲基亞砜購自Sigma公司。細(xì)胞培養(yǎng)于含有10% FBS、100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基，37℃的5% CO2培養(yǎng)箱中，生長至80%左右濃度時進行傳代和凍存，用于后續(xù)的實驗。細(xì)胞培養(yǎng)瓶和24、96孔板購自杭州四季慶生物工程材料有限公司。Trizol購自美國Ambion公司，Mcl-1抗體購買于美國abcam公司。逆反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TOYOBO公司，PCR試劑盒購自美國Kapa公司。熒光素酶活性檢測試劑盒購自Promega公司。熒光素酶報告載體由Promega公司合成。miR-29b mimics和inhibitor購自GenePharma(中國上海)。

1.3SPC-A1細(xì)胞分組將200 μl含有100 pmol miR-29b mimics的無血清、無抗生素培養(yǎng)基與含5 μl Lipofectamine 2000(Invitrogen)的200 μl相同培養(yǎng)基混合，并靜置20 min。然后將所得的400 μl轉(zhuǎn)染溶液加入含有1.6 ml培養(yǎng)基的每個孔中。6 h后，用補充有10%FBS和青霉素及鏈霉素的2 ml新鮮培養(yǎng)基代替培養(yǎng)物。同樣方法處理miR-29b inhibitor和miR-29b control。將分別轉(zhuǎn)染miR-29b mimics、miR-29b inhibitor和miR-29b control的SPC-A1細(xì)胞，分為miR-29b mimics組、miR-29b inhibitor組和對照組。

1.4定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)使用Trizol試劑提取非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株以及肺癌組織和癌旁正常組織的總RNA，并使用TM miRNA分離試劑盒(Ambion, Austin, TX, USA)進一步純化miRNA部分。通過超微量分光光度計測定RNA樣品的濃度和純度。使用實時PCR系統(tǒng)進行實時逆轉(zhuǎn)錄PCR。miR-29b前引物：5'-GGTACCGGTTGTCTTGGGTTTATTG-3'，后引物：5'-GAATTCAAATACTTCAGAGCTG-3'；Mcl-1克隆的前引物：5'-CGGGGTACCGAGTCATACTTGTGAAG-3'，后引物：3'-GCACTCGAGCCTGTTTTTGTTTGATG-5'。U6管家基因作為對照。以100 ng總RNA為模版，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，反應(yīng)條件：95℃ 10 min，45個循環(huán)；95℃變性10 s，60℃退火和延伸60 s。使用RQ=2-ΔΔCt方法計算非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株以及肺癌組織和癌旁正常組織的miRNA相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

1.5Western blotting實驗檢測Mcl-1蛋白SPC-A1細(xì)胞用冰PBS洗滌，然后用蛋白質(zhì)裂解物(Pierce, Rockford, IL, USA)裂解。在4℃下以5000×g離心15 min，用二亞鉻酸蛋白測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。按照說明書配制10% SDS-PAGE分離膠，每孔加入20 μg蛋白樣品。使用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，TBST充分沖洗后，使用1∶1000稀釋一抗孵育(兔單克隆Mcl-1抗體)，4℃過夜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶2500)稀釋，室溫孵育2 h；ECL發(fā)光。實驗重復(fù)3次。

1.6雙熒光素酶實驗使用雙熒光素酶實驗驗證miR-29b和Mcl-1的關(guān)系。將SPC-A1細(xì)胞接種與24孔板中，與0.4 mg螢火蟲熒光素酶報告載體和0.1 mg含有海腎螢光素酶的pRL-TK對照載體共轉(zhuǎn)染，根據(jù)siPORTneoFX使用方法操作，在轉(zhuǎn)染后48 h制備裂解物。轉(zhuǎn)染24 h后使用雙熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)測定熒光素酶活性。實驗重復(fù)3次。

1.7MTT增殖實驗將對數(shù)期SPC-A1細(xì)胞使用胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸浮液并以1×103個細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中。在細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，加入MTT測定液20 μl，每孔充分混合均勻，并在37℃下孵育4～6 h。然后使用無菌吸管吸出上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μl，在室溫下攪拌10 min保證晶體充分溶解。然后在細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72和96 h進行MTT測定波長為490 nm時的吸光度(OD)，計算SPC-A1細(xì)胞的增殖情況。實驗重復(fù)3次。

1.8細(xì)胞凋亡實驗使用Annexin V-Fluos染色試劑盒(Roche-Boehringer)檢測SPC-A1細(xì)胞的凋亡情況。SPC-A1細(xì)胞應(yīng)用PBS洗滌，并根據(jù)試劑盒說明書進行染色。將載玻片與Permafluor介質(zhì)一起安裝，并在熒光顯微鏡(Axiophot; Olympus, Tokyo, Japan)下觀察。

2　結(jié)果

2.1肺癌組織和癌旁正常組織miR-29b的表達(dá)肺癌組織和癌旁正常組織miR-29b表達(dá)水平分別為0.56±0.13和1.68±0.24。肺癌組織miR-29b表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織(P<0.05)。

2.2SPC-A1細(xì)胞miR-29b的表達(dá)miR-29b mimics組SPC-A1細(xì)胞miR-29b的表達(dá)水平為6.15±0.76，miR-29b inhibitor組為0.52±0.24，對照組為1.10±0.19。miR-29b mimics組SPC-A1細(xì)胞miR-29b的表達(dá)水平高于對照組(P<0.05)，miR-29b inhibitor組低于對照組(P<0.05)。

2.3miR-29b對SPC-A1細(xì)胞增殖的影響在培養(yǎng)72 h和96 h時，miR-29b mimics組的OD值分別為0.56±0.02和0.65±0.07，對照組分別為0.64±0.03和0.78±0.05。miR-29b inhibitor組培養(yǎng)96 h時的OD值為0.86±0.01。培養(yǎng)72 h和96 h時，miR-29b mimics組的增殖活性顯著低于對照組(P<0.05)。培養(yǎng)96 h時，miR-29b inhibitor組的增殖活性明顯高于對照組(P<0.05)。見圖1。

圖1　miR-29b對SPC-A1細(xì)胞增殖的影響 與對照組比較，aP<0.05

2.4miR-29b對SPC-A1細(xì)胞凋亡的影響miR-29b mimics組、miR-29b inhibitor組和對照組SPC-A1細(xì)胞凋亡率分別為(37.28±5.11)%、(9.25±1.26)%和(21.69±7.38)%。miR-29b mimics組SPC-A1細(xì)胞凋亡率高于對照組(P<0.05)，miR-29b inhibitor組低于對照組(P<0.05)。

2.5miR-29b靶向調(diào)控Mcl-1的表達(dá)生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果顯示，miR-29b與Mcl-1有類似的3'-UTR結(jié)合序列。雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-29b mimics后可以明顯抑制Mcl-1的熒光素酶活性。Western blotting實驗結(jié)果顯示，miR-29b mimics組、miR-29b inhibitor組和對照組Mcl-1蛋白表達(dá)水平分別為0.42±0.12、1.89±0.07和1.02 ±0.02。miR-29b mimics組Mcl-1蛋白表達(dá)水平低于對照組(P<0.05)，miR-29b inhibitor組高于對照組(P<0.05)。見圖2。

圖2miR-29b和Mcl-1之間的關(guān)系以及miR-29b對Mcl-1蛋白表達(dá)的影響

A.miR-29b和Mcl-1的結(jié)合位點；B.雙熒光素酶檢測miR-29b和Mcl-1之間的關(guān)系；C.miR-29b對Mcl-1蛋白表達(dá)的影響；Mcl-1為髓細(xì)胞白血病因子-1

3　討論

miRNA是一類內(nèi)源性的小RNA，長度通常少于22個核苷酸[14]。miRNA作為一種非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后能調(diào)控靶RNA的表達(dá)[15]。miRNA參與了許多生物學(xué)進程，在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起到關(guān)鍵的作用，其中也包括腫瘤，而且在腫瘤中存在明顯的表達(dá)差異[16-17]。在一些腫瘤發(fā)病過程中，miRNA通過靶向作用某些生物學(xué)信號途徑來改變腫瘤細(xì)胞的表型，成為腫瘤形成過程中的重要一環(huán)，而且還能作為診斷和預(yù)測生存預(yù)后的分子標(biāo)記物[18]?；趍iRNA治療的發(fā)展代表了腫瘤治療的新策略。通過同時調(diào)節(jié)多種生物信息途徑，miRNA可以作為腫瘤抑制因子或致癌基因，調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展過程，包括增殖，侵襲，凋亡和轉(zhuǎn)移等[16]。miR-29b能靶向致癌基因和抗凋亡基因，在多種癌癥發(fā)病過程中通常被沉默或下調(diào)[19]。在急性骨髓性白血病中，CDK6已被證實為miR-29b直接作用靶點[20]。miR-29b的過表達(dá)可預(yù)防人乳頭狀瘤病毒介導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[21]。而在非小細(xì)胞肺癌中，miR-29b作用的靶基因為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A和3B，且其表達(dá)與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A和3B表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[16]。本實驗結(jié)果表明，miR-29b表現(xiàn)出與肺癌較高的相關(guān)性，其表達(dá)的降低與腫瘤的形成負(fù)相關(guān)，同時還影響了肺癌細(xì)胞的增殖和凋亡，所以能起到了一定的抑癌作用。

Mcl-1是一種抗凋亡蛋白，其表達(dá)不足易導(dǎo)致細(xì)胞在不適當(dāng)時機凋亡，而過度表達(dá)易引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化風(fēng)險的增加[22]。通常在腫瘤組織中Mcl-1表現(xiàn)為過表達(dá)。如Mcl-1的過度表達(dá)導(dǎo)致膽管癌細(xì)胞對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抗性，而其抑制劑使細(xì)胞對凋亡敏感[23]。Mcl-1蛋白水平的調(diào)節(jié)是復(fù)雜的，在轉(zhuǎn)錄層面，Mcl-1 mRNA是由細(xì)胞因子白介素-3(IL-3)、IL-5、IL-6、IL-15、IL-22、干擾素-α、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和表皮生長因子受體所調(diào)控[24]。鑒于Mcl-1調(diào)節(jié)的復(fù)雜性，可能還存在其他的調(diào)控機制。最近的研究已經(jīng)表明，microRNAs能對蛋白質(zhì)的表達(dá)進行調(diào)節(jié)[25]。miRNA作為內(nèi)源性序列特異性抑制靶基因翻譯，從而可以降低靶蛋白表達(dá)[26]。如miR-15和miR-16有與Bcl-2 mRNA互補性的堿基序列，過表達(dá)miR-15和miR-16可導(dǎo)致Bcl-2蛋白減少和細(xì)胞凋亡增加[27]。在急性骨髓性白血病、膽管癌和肝細(xì)胞癌中，miR-29b已被證明靶向Mcl-1蛋白的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞生存[28-30]。本研究結(jié)果表明，miR-29b具有和Mcl-1相似的3'-UTR結(jié)合序列。雙熒光素酶實驗結(jié)果表明，miR-29b能與Mcl-1的3'-UTR特異性結(jié)合，并抑制Mcl-1蛋白的表達(dá)活性。

綜上所述，肺癌組織中miR-29b的表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織，同時miR-29b能抑制肺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，miR-29b能與Mcl-1的3'-UTR特異性結(jié)合，并抑制Mcl-1蛋白的表達(dá)活性。miR-29b可以成為肺癌治療的新靶點。

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