李志偉，杜偉強(qiáng)，繆　琴

鼻息肉是鼻部常見病，好發(fā)于成年人，且多見于上頜竇、篩竇、中鼻道及中鼻甲等處[1-2]。以往多采用藥物保守治療，但效果欠佳，目前臨床上主張采用手術(shù)治療，尤其是功能性鼻內(nèi)鏡手術(shù)效果較好，但仍有20%的復(fù)發(fā)率[3-4]。為進(jìn)一步改進(jìn)治療方法，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)86%患者鼻息肉組織中可檢測到血清抗Epstain-Barr病毒-潛伏膜蛋白1(EBV-LMP1)抗體，并認(rèn)為EBV感染可能與鼻息肉發(fā)病有重要關(guān)系[5]。故本研究檢測鼻息肉患者手術(shù)前后與正常人群血清抗EBV-LMP1抗體水平情況，并分析抗EBV-LMP1抗體檢測的臨床意義，現(xiàn)報告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2015年6月—2016年6月在本院收治的鼻息肉患者202例為研究對象。①納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)功能性鼻內(nèi)鏡手術(shù)治療，且術(shù)后病理檢查確診為鼻息肉；無手術(shù)并發(fā)癥；無嚴(yán)重心、肝、腎等臟器功能損傷；均無精神及語言、溝通交流障礙；患者及家屬知情且簽署知情同意書。②排除標(biāo)準(zhǔn)：有手術(shù)禁忌證；有相關(guān)藥物過敏史；同一時間段患者已參加其他相關(guān)研究調(diào)查項(xiàng)目。將202例鼻息肉患者設(shè)為觀察組，選取同時間段的101名正常人設(shè)為對照組，并簽署知情同意書。觀察組男114例，女88例；年齡18～78(45.47±6.83)歲；對照組男54例，女47例；年齡19～79(45.38±6.75)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意執(zhí)行。

1.2方法

1.2.1試劑：采用實(shí)驗(yàn)室表達(dá)與保存的谷胱甘肽-EBV-LMP1胞外區(qū)融合蛋白(GST-LMP1)、BSA及Tween-20購自美國Amreso公司，蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量購自加拿大Fermentas公司，DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，過氧化氫氧化3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色試劑盒購自美國Pierce公司；山羊抗人IgG-HRP購自中杉金橋公司。GAPDH Antibody-HRP購自美國GenScript公司。

1.2.2手術(shù)方式：給予患者行鼻竇冠狀位CT掃描并掌握病變范圍，全部患者均采用全身麻醉。待麻醉起效后，患者取仰臥位，術(shù)者根據(jù)Messerklinger術(shù)式依次切除鉤突[6]，開放前后篩竇及蝶竇、額竇和上頜竇，鼻息肉嚴(yán)重者先切除鼻息肉，手術(shù)主要在Messerklinger鼻科電動吸切器下完成，術(shù)畢，將凡士林紗條和明膠海綿均勻填塞在患者的鼻腔內(nèi)。

1.2.3ELISA檢測血清中特異性抗體：手術(shù)前后抽取患者外周靜脈血3～5 ml，3000 r/min離心20 min，分離血清待測。具體步驟如下：GST-LMP1融合蛋白用包被液1∶100稀釋為100 ng/孔，50 μl/孔4℃過夜；棄上液，0.1% PBST(Tween-20)300 μl/孔，洗3次，甩干；加封閉液(PBS加5%脫脂奶粉)200 μl/孔，封閉2 h；棄上液，0.1% PBST(Tween-20)300 μl/孔，洗3次，甩干；每份血清以1∶100用封閉液稀釋，加入100 μl/孔，陰性對照加封閉液100 μl/孔，37℃下孵育1 h；棄一抗，0.1% PBST(Tween-20)300 μl/孔，洗3次，甩干；加HRP偶聯(lián)的二抗，50 μl/孔，置于濕盒內(nèi)，37℃下孵育1 h；棄二抗，0.1% PBST(Tween-20)300 μl/孔，洗3次，紙上拍干；加入TMB顯色液100 μl/孔；加終止液(2 mol/L的H2SO4)終止反應(yīng)，ELISA讀數(shù)儀讀取OD值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.4Western blot檢測血清中特異性抗體：分為觀察組與對照組，應(yīng)用純化GST-LMP1融合蛋白在12% SDS-PAGE上電泳。電泳結(jié)束，電轉(zhuǎn)膜(BIO-RAD)300 mA，1.5 h后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜。用封閉液(PBST加5%脫脂奶粉)封閉4℃過夜。觀察組用一抗(PBS液1∶100稀釋手術(shù)前后鼻息肉患者血清)；對照組用一抗(PBS液1∶100稀釋正常人血清)，室溫孵育1 h。PBST洗膜3次，每次5 min。加HRP偶聯(lián)的二抗(1∶2500山羊抗人IgG抗體)，室溫孵育1 h。PBST洗膜3次，每次5 min，DAB顯色，雙蒸水終止反應(yīng)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2　結(jié)果

2.1抗EBV-LMP1抗體水平對比觀察組術(shù)前以及術(shù)后第1、2、4和6個月的抗EBV-LMP1抗體水平分別為0.982±0.143、0.917±0.142、0.867±0.135、0.641±0.128和0.516±0.113，對照組為0.400±0.099。觀察組術(shù)前抗EBV-LMP1抗體水平高于對照組(P<0.001)。術(shù)后第1和2個月，觀察組抗EBV-LMP1抗體水平與術(shù)前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后第4和6個月，觀察組抗EBV-LMP1抗體水平低于術(shù)前及術(shù)后第1和2個月(P<0.05)。

2.2條帶相對灰度值對比術(shù)前、術(shù)后第1、2、4和6個月，觀察組的條帶相對灰度值分別為0.992±0.013、0.968±0.015、0.528±0.026、0.479±0.024和0.207±0.006，對照組為0.110±0.019。觀察組術(shù)前條帶相對灰度值高于對照組(P<0.001)。術(shù)后第1個月，觀察組條帶相對灰度值與術(shù)前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后第2、4和6個月，觀察組條帶相對灰度值低于術(shù)前及術(shù)后第1個月(P<0.05)。觀察組術(shù)后第2、4和6個月的條帶相對灰度值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1Westernblot法檢測鼻息肉患者和正常人血清抗EBV-LMP1抗體水平

1～5為鼻息肉患者術(shù)前、術(shù)后第1、2、4、6個月，6為正常人

3　討論

鼻息肉的發(fā)病機(jī)制仍然屬于醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，但其病因復(fù)雜，至今尚未明確[7]。目前有以下幾種學(xué)說，包括中鼻道微環(huán)境學(xué)說、鼻變態(tài)反應(yīng)學(xué)說、嗜酸性粒細(xì)胞炎癥學(xué)說、細(xì)菌超抗原學(xué)說等。但鼻息肉屬于一種慢性炎癥疾病，組織學(xué)表現(xiàn)為呼吸上皮遮蓋著極度水腫的間質(zhì)，間質(zhì)中有炎性細(xì)胞浸潤，作為一種以上皮細(xì)胞損傷和組織水腫為特征的炎癥性病變，其發(fā)病機(jī)制存在多種可能[8]。而鼻息肉好發(fā)于雙側(cè)，單側(cè)較少，持續(xù)性鼻塞且伴隨息肉體積長大而加重較為常見[9-10]；且鼻腔內(nèi)分泌物(漿液性或黏液性，如并發(fā)鼻竇感染，分泌物可為膿性)增多，會伴有噴嚏，有時會引起嗅覺障礙，鼻塞重者說話呈閉塞性鼻音，睡眠時打鼾，息肉蒂長者可感到鼻腔內(nèi)有物隨呼吸移動。后鼻孔有息肉時可致經(jīng)鼻呼氣困難，如息肉阻塞咽鼓管口，可引起耳鳴和聽力減退，息肉阻塞鼻竇引流，可引起鼻竇炎，患者可出現(xiàn)鼻背、額部及面頰部脹痛不適等，嚴(yán)重影響患者的正常生活[11-12]。以往采用藥物保守治療效果欠佳，目前臨床上主張采用以手術(shù)為主的綜合治療，尤其是功能性鼻內(nèi)鏡手術(shù)效果較好，認(rèn)真進(jìn)行術(shù)后隨訪及護(hù)理，能提高治愈率，但仍有20%的復(fù)發(fā)率[13-14]。

目前，鼻息肉主要以手術(shù)治療為主，據(jù)有關(guān)學(xué)者統(tǒng)計，傳統(tǒng)手術(shù)切除息肉術(shù)后復(fù)發(fā)率為30%～50%[15-17]。而采取功能性鼻內(nèi)鏡手術(shù)治療，可徹底切除鼻息肉和息肉樣變黏膜，重建鼻竇引流并為矯正鼻腔的解剖異常提供較傳統(tǒng)手術(shù)更為優(yōu)越的條件[18-19]。有學(xué)者研究認(rèn)為，手術(shù)僅是治療方案的第一步，而術(shù)后上皮再生恢復(fù)階段尤為重要，且會向兩個不同方向發(fā)展，其一可以愈合為主體，最終完成上皮化；其二可再生病變息肉或肉芽，結(jié)締組織再生導(dǎo)致不全上皮而形成炎癥，影響手術(shù)療效甚至手術(shù)失敗[20-21]?？紤]到可能由于在慢性炎癥的長期刺激下，黏膜的部分病理性改變不可逆，但有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，鼻甲黏膜炎性細(xì)胞的浸潤程度是預(yù)測鼻內(nèi)鏡術(shù)后是否復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)，有助于預(yù)測鼻內(nèi)鏡手術(shù)后是否存在部分鼻息肉癥狀[22]。

有學(xué)者研究EBV在上皮源性腫瘤發(fā)展中的作用與機(jī)制，尤其是EBV-LMP1與上皮源性腫瘤病因發(fā)病有密切的關(guān)系[23-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組術(shù)前抗EBV-LMP1抗體水平高于對照組。術(shù)后第1和2個月，觀察組的抗EBV-LMP1抗體水平與術(shù)前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。術(shù)后第4和6個月，觀察組的抗EBV-LMP1抗體水平低于術(shù)前及術(shù)后第1和2個月。觀察組術(shù)前條帶相對灰度值高于對照組。術(shù)后第1個月，觀察組條帶相對灰度值與術(shù)前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。術(shù)后第2、4和6個月，觀察組條帶相對灰度值低于術(shù)前及術(shù)后第1個月。觀察組術(shù)后第2、4和6個月的條帶相對灰度值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。重復(fù)檢測3次，結(jié)果一致，表明鼻息肉發(fā)病和EBV的感染有高度相關(guān)性，鼻息肉血清抗體水平較術(shù)前顯著降低，并隨術(shù)后隨訪時間的延長而下降，故可通過監(jiān)測抗EBV-LMP1抗體水平的變化判定臨床治療效果。若水平升高，則預(yù)示疾病復(fù)發(fā)可能，需加強(qiáng)治療；若水平維持不變或降低，則預(yù)示疾病逐漸趨于治愈，可繼續(xù)原治療方案。

綜上所述，鼻息肉與EBV感染有相關(guān)性，功能性鼻內(nèi)鏡手術(shù)可有效地治療鼻息肉患者癥狀，并隨著術(shù)后綜合治療時間的延長，血清抗EBV-LMP1抗體水平降低，臨床上可通過檢測血清抗EBV-LMP1抗體水平作為評價該病的臨床療效指標(biāo)。

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