要榮宇，王靜慧，楊喬木，吳瑞妮，霍乃蕊

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，四川成都611130；2.山西出入境檢驗(yàn)檢疫局，山西太原030024；3.太原市食品藥品監(jiān)督管理局，山西太原030031；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801）

嗜酸乳桿菌屬乳桿菌屬，是乳酸菌中非常重要的益生菌之一，被稱為第三代乳酸發(fā)酵劑菌種[1]。嗜酸乳桿菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群、提高免疫力、降低血脂、降低產(chǎn)毒微生物的活性、防止乳糖不耐受等功能。地衣芽孢桿菌屬厚壁菌門，是一種常見的革蘭氏陽性細(xì)菌，廣泛存在于土壤、空氣和腐敗有機(jī)物中。地衣芽孢桿菌已經(jīng)應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，其商品名為整腸生，主要運(yùn)用于腸道疾病的治療，對腸炎、菌痢等具有明顯療效[2]。

原生質(zhì)體融合即細(xì)胞融合，是指將兩親本菌株的細(xì)胞壁通過酶解脫壁，形成球狀的原生質(zhì)體后，在高滲條件下使其相互接觸，通過膜融合、細(xì)胞質(zhì)融合、核融合，最終基因組之間發(fā)生接觸、交換，進(jìn)而發(fā)生基因重組，最后在適宜的條件下再生出細(xì)胞壁來，獲得陽性重組子的過程。原生質(zhì)體融合具有重組頻率高、遺傳穩(wěn)定、可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交、可集合雙親優(yōu)良性狀的優(yōu)點(diǎn)，所以在微生物育種領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[3-5]。王成濤等[6]利用原生質(zhì)體融合技術(shù)將芽孢桿菌T12-1與嗜熱鏈球菌及嗜酸乳桿菌C3進(jìn)行融合，得到2株高效降低膽固醇的乳酸菌融合子，可顯著降低蛋黃乳等食品中的膽固醇含量，同時兼具乳酸菌發(fā)酵食品的風(fēng)味特征。呂兵等[7]將專性厭氧的短雙歧桿菌和典型的啤酒上面酵母進(jìn)行原生質(zhì)體融合，成功篩選出遺傳較穩(wěn)定的BSF1和BSF2，改善了雙歧桿菌的耐氧特性，為厭氧性益生菌的改良提供了思路。王玉華[8]將2株不同來源的嗜酸乳桿菌La-w1和La-w2融合后獲得菌株La-F1，其耐酸性和耐膽鹽能力明顯高于原菌株。黎永學(xué)等[9]將雙歧桿菌和釀酒酵母進(jìn)行原生質(zhì)體融合可得到遺傳穩(wěn)定的融合子，實(shí)現(xiàn)了厭氧菌和酵母的跨界融合，為雙歧桿菌生物學(xué)功能的開發(fā)提供了新途徑。

實(shí)驗(yàn)室在前期成功制得嗜酸乳桿菌-地衣芽孢桿菌融合子，在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化融合子的培養(yǎng)條件，考察培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)溫度、pH值、氧氣濃度對融合子生成量的影響進(jìn)行分析，確定融合子的適宜培養(yǎng)條件，為融合子的制劑化研究及工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1　材料

1.1.1　菌株

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus），地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）購于中科院微生物研究所。嗜酸乳桿菌-地衣芽孢桿菌融合子由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動科院動物衛(wèi)檢實(shí)驗(yàn)室制備。

1.1.2　試劑與設(shè)備

牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、葡萄糖、酵母浸膏、吐溫80、瓊脂粉：北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鈉、檸檬酸三銨、硫酸錳、醋酸鈉、溴甲酚紫（均為分析純）：天津市化學(xué)試劑六廠。

722E型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；PHS-25C型酸度計：上海大普儀器有限公司；HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東連電子技術(shù)開發(fā)有限公司；XW-80A型漩渦混合器：北京科偉永興儀器有限公司；DF205型離心機(jī)：北京科偉永興儀器有限公司；LRHS-150型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.1.3　培養(yǎng)基的配制

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖 20 g，Tween-80 1 mL，醋酸鈉 5 g，K2HPO42 g，檸檬酸銨2 g，MgSO4·7H2O 0.58g，蒸餾水1 000 mL，MnSO4·4H2O 0.2 g （固體培養(yǎng)基加入 15 g～20 g瓊脂）pH 6.2～6.6，將mgSO4·7H2O，MnSO4·4H2O，葡萄糖，Tween-80以外的成分溶解，冷至50℃。然后加入MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O，最后加入葡萄糖和 Tween-80。過濾分裝，121℃高壓滅菌15 min。在MRS液體培養(yǎng)基中添加1.5%瓊脂制備固體培養(yǎng)基。

CM培養(yǎng)基（肉湯培養(yǎng)基）：蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，酵母膏 3 g，牛肉膏 3 g，MgSO4·7H2O 2 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。固體培養(yǎng)基瓊脂粉用量為2%（15 g～20 g）。按照所需劑量，將配制好的培養(yǎng)基分裝在三角瓶中，121℃高壓滅菌30 min，備用。

BPM培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）：牛肉膏3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0～7.2。固體培養(yǎng)基瓊脂粉用量為2%（15 g～20 g）。按照所需劑量，將配制好的培養(yǎng)基分裝在三角瓶中，121℃高壓滅菌，備用。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。固體培養(yǎng)基瓊脂粉用量為2%（15 g～20 g）。按照所需劑量，將配制好的培養(yǎng)基分裝在三角瓶中，121℃高壓滅菌，備用。

1.2　試驗(yàn)方法

1.2.1　融合子菌落形態(tài)觀察

將融合子接種到不同液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，革蘭氏染色后進(jìn)行鏡檢，觀察菌體在液體培養(yǎng)基中的個體形態(tài)。

將融合子劃線接種到固體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)36 h，長出單菌落，挑取菌體，革蘭氏染色后進(jìn)行鏡檢，觀察菌體在固體培養(yǎng)基上的個體形態(tài)。

1.2.2　融合子培養(yǎng)條件的確定

1.2.2.1　培養(yǎng)基對融合子生長量的影響

按照配方分別配制MRS液體培養(yǎng)基、CM液體培養(yǎng)基、BPM液體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌。將活化好的融合子在無菌條件下按5%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種于不同液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，每3 h取樣一次，測定OD600值。

1.2.2.2　起始pH值對融合子生長量的影響

分別配制pH值為4、5、6、7、8的4種液體培養(yǎng)基。將活化好的融合子以5%（體積分?jǐn)?shù)）接種量在無菌條件下分別接種，37℃恒溫培養(yǎng)12 h，測定其OD600值。

1.2.2.3　培養(yǎng)溫度對融合子生長量的影響

分別配制4種培養(yǎng)基，將活化好的融合子以5%（體積分?jǐn)?shù)）接種量在無菌條件下分別接種，并于20、25、30、35 ℃條件下培養(yǎng) 12 h，測定其 OD600值。

1.2.2.4　培養(yǎng)方式對融合子生長量的影響

1）通氣狀態(tài)搖床培養(yǎng)

將活化好的融合子以5%（體積分?jǐn)?shù)）接種量在無菌條件下接種于不同液體培養(yǎng)基中，瓶口加蓋棉塞，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，140 r/min，第12小時、第24小時取樣測定OD值。

2）隔氧狀態(tài)靜置培養(yǎng)

在無菌條件下，將每種培養(yǎng)基各吸取9.5 mL置于10 mL滅菌的EP管中，然后將活化好的融合子各取0.5 mL接種于4種培養(yǎng)基的EP管中，搖勻后石蠟密封，37℃靜置培養(yǎng)，每12 h取樣一次測定OD值。

1.2.3　融合子產(chǎn)酸性能分析

1.2.3.1　定性產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)

將活化好的融合子以5%（體積分?jǐn)?shù)）接種量在無菌條件下接種于不同液體培養(yǎng)基中，并分別滴入2滴溴甲酚紫溶液，37℃恒溫培養(yǎng)，觀察試管顏色變化。如果試管中的培養(yǎng)液的顏色由紫色變?yōu)辄S色則說明菌種產(chǎn)酸，否則不產(chǎn)酸。

1.2.3.2　總酸測定

將活化好的融合子以5%（體積分?jǐn)?shù)）接種量在無菌條件下接種于不同液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)。每隔12小時取不同培養(yǎng)基的培養(yǎng)液10 mL，分別加入蒸餾水20 mL，滴加2滴～3滴0.5%酚酞指示劑，用0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）進(jìn)行滴定，滴定至微紅為止，根據(jù)公式計算出乳酸生成量。

式中：C表示氫氧化鈉的濃度，mol/L；V1表示消耗氫氧化鈉的體積，mL；V2表示加入樣品的體積，mL；90.08表示乳酸的摩爾質(zhì)量。

2　試驗(yàn)結(jié)果

2.1　融合子的個體形態(tài)

2.1.1　融合子在不同液體培養(yǎng)基中的個體形態(tài)

圖1（A、B、C、D）分別為融合子在CM液體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基、BPM液體培養(yǎng)基中的個體形態(tài)。

圖1　融合子在不同液體培養(yǎng)基中的個體形態(tài)（L：10×100）Fig.1　Individual morphology of fusant in different liquid culture medium

經(jīng)顯微鏡觀察可知，融合子為革蘭氏陽性菌。在CM液體培養(yǎng)基中為桿狀，呈長鏈狀排列；而在LB液體培養(yǎng)基中為短桿菌，單個排列或成短鏈狀排列；融合子在MRS液體培養(yǎng)基中菌數(shù)較少，可觀察到的融合子菌體呈長鏈狀排列；在BPM液體培養(yǎng)基中則為短桿菌，單個排列或成短鏈狀排列。

2.1.2　融合子在不同固體培養(yǎng)基中的個體形態(tài)

圖2　融合子在不同固體培養(yǎng)基中的個體形態(tài)（L：10×100）Fig.2　Individual morphology of fusant in different solid culture medium

圖2（E、F、G）分別為融合子在BPM固體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、CM固體培養(yǎng)基中的個體形態(tài)。融合子在BPM固體培養(yǎng)基中為短桿菌，多為單個排列，產(chǎn)芽孢；在LB固體培養(yǎng)基為短桿菌，多為單個排列或短鏈狀排列，產(chǎn)芽孢；在CM固體培養(yǎng)基中為單個排列或短鏈狀排列并產(chǎn)芽孢的桿菌。

融合子在BPM固體培養(yǎng)基中為短桿菌，多為單個排列，產(chǎn)芽孢；在LB固體培養(yǎng)基為短桿菌，多為單個排列或短鏈狀排列，產(chǎn)芽孢；在CM固體培養(yǎng)基中為單個排列或短鏈狀排列并產(chǎn)芽孢的桿菌。

2.2　不同培養(yǎng)基對融合子生長的影響

圖3為融合子在不同培養(yǎng)基中的生長曲線圖。

圖3　融合子在不同培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.3　Growth curve of fusant in different medium

由圖3可知，融合子在MRS培養(yǎng)基中的OD值顯著低于其他培養(yǎng)基（P＜0.05），且延滯期較長；融合子在BPM培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中，3 h～9 h為對數(shù)生長期，之后進(jìn)入穩(wěn)定期；在CM培養(yǎng)基中，3 h～12 h為對數(shù)生長期，12 h后進(jìn)入衰亡期，12 h時其OD值（1.576±0.011）顯著高于其他培養(yǎng)基（P＜0.05），說明CM培養(yǎng)基對融合子的生長更加有利。

2.3　起始pH值對融合子生長量的影響

圖4為培養(yǎng)基的不同pH值對融合子生長量的影響。

圖4　培養(yǎng)基不同起始pH值對融合子生長量的影響Fig.4　Effect of different initial pH values on the growth of the fusant

如圖4所示，融合子在MRS培養(yǎng)基、BPM培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中生長，雖然pH值不同，OD值也不同，但是差異并不顯著（P＞0.05）。而在CM培養(yǎng)基中，pH值的差異導(dǎo)致OD值變化顯著（P＜0.05），隨著pH值的升高，OD值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在pH值為6時，融合子OD值最高，達(dá)到0.292。由圖4可知，在MRS培養(yǎng)基、BPM培養(yǎng)基、CM培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中，融合子的最適生長pH值分別為7、7、6、5。

2.4　培養(yǎng)溫度對融合子生長量的影響

圖5為培養(yǎng)溫度對融合子生長的影響。

由圖5可知，融合子在MRS培養(yǎng)基和BPM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度對OD值的影響并不顯著（P＞0.05）；在LB和CM培養(yǎng)基中，隨著溫度的增高，OD值均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，特別是溫度對生長在CM培養(yǎng)基中的融合子影響顯著，溫度為37℃時，OD值顯著增加并達(dá)到最高。由圖可確定，在MRS培養(yǎng)基、BPM培養(yǎng)基、CM培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中，融合子的最適生長溫度分別為 37、35、37、35 ℃。

2.5　培養(yǎng)方式對融合子生長量的影響

將融合子接種于不同培養(yǎng)基中，分別采用有氧培養(yǎng)（通氧搖床）和厭氧培養(yǎng)（隔氧靜置）兩種方式進(jìn)行培養(yǎng)，測定培養(yǎng)液OD值，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，融合子在MRS培養(yǎng)基中隔氧靜置培養(yǎng)12 h和24 h，所測得的OD值均高于通氧搖床培養(yǎng)測定的OD值。融合子在BPM培養(yǎng)基、CM培養(yǎng)基及LB培養(yǎng)基中，通氧搖床所測定的OD值均高于隔氧靜置培養(yǎng)。說明在MRS培養(yǎng)基中，隔氧靜置培養(yǎng)更有利于融合子生長；而在BPM培養(yǎng)基、CM培養(yǎng)基及LB培養(yǎng)基中，通氧培養(yǎng)方式更為適合。

2.6　融合子產(chǎn)酸性能分析

2.6.1　定性產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過融合子溴甲酚紫顯色反應(yīng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MRS培養(yǎng)基和CM培養(yǎng)基均呈黃色，說明融合子在這兩種培養(yǎng)基中能夠產(chǎn)酸；BPM培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基呈紫色，說明融合子在這兩種培養(yǎng)基中產(chǎn)酸不佳。

表1　培養(yǎng)方式對融合子生長量的影響Table 1　Effects of culture methods on the growth of fusant

2.6.2　融合子總酸測定結(jié)果

融合子在不同培養(yǎng)基中的乳酸生成量如圖6所示。

圖6　不同培養(yǎng)基中融合子乳酸生成量測定Fig.6　Determination of lactic acid production in different medium

由圖6可知，融合子在4種培養(yǎng)基中的乳酸生成量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在培養(yǎng)前期，培養(yǎng)液中的總酸積累較少，酸度環(huán)境較為適宜融合子的生長，培養(yǎng)基中乳酸量不斷升高；培養(yǎng)一段時間后，培養(yǎng)液中總酸積累量較高，酸度上升，此時酸度環(huán)境可能會對融合子的生長產(chǎn)生抑制，甚至發(fā)生自溶，從而導(dǎo)致產(chǎn)酸量下降。在不同培養(yǎng)時段，融合子在MRS培養(yǎng)基中乳酸生成量顯著高于其他培養(yǎng)基，培養(yǎng)36 h，乳酸生成量最高，達(dá)到2.30 g/L。

3　討論與結(jié)論

對于微生物來說，即使是同一菌株，在不同培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，其生長情況和代謝方式也不盡相同[10]。目前，關(guān)于嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌培養(yǎng)特性的相關(guān)報道已經(jīng)較為詳盡，而嗜酸乳桿菌-地衣芽孢桿菌融合子的培養(yǎng)特性尚未見報道。嗜酸乳桿菌為乳酸菌屬，一般采用MRS培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)。地衣芽孢桿菌的最佳生長溫度為35℃，最適pH值為7.0。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CM培養(yǎng)基（肉湯培養(yǎng)基）成為最適合嗜酸乳桿菌-地衣芽孢桿菌融合子生長的培養(yǎng)基，其次為BPM培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基。CM培養(yǎng)基是最經(jīng)典的細(xì)菌培養(yǎng)基之一，可以用于各種細(xì)菌的培養(yǎng)。BPM瓊脂培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基可為微生物生長提供氮源、碳源、磷酸鹽、維生素和無機(jī)鹽。MRS培養(yǎng)基是用于鑒別、分離乳酸菌的專用培養(yǎng)基[11]。本試驗(yàn)通過鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)融合子在液體和固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)與親本的菌落形態(tài)明顯不同，這是基因重組的結(jié)果[12-13]?；蛑亟M不僅導(dǎo)致融合子的菌落形態(tài)發(fā)生變化，而且最適培養(yǎng)基的種類也發(fā)生了改變。嗜酸乳桿菌在MRS培養(yǎng)基中生長良好，但是與地衣芽孢桿菌融合后，CM成為了最適培養(yǎng)基，培養(yǎng)方式也以通氧搖床培養(yǎng)為佳。但是就產(chǎn)酸性能分析，融合子在MRS培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸量最大，說明MRS培養(yǎng)基更有利于融合子的繁殖代謝，產(chǎn)生包括乳酸在內(nèi)的次級產(chǎn)物。

嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌的融合子兼具兩親本的優(yōu)良特性。乳酸菌和地衣芽孢桿菌都是對人體有益的益生菌，融合子既具備了地衣芽孢桿菌較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)淀粉酶能力以及形成芽孢的能力，也具有了乳酸菌耐受胃部的低酸環(huán)境以及腸道前段高膽鹽環(huán)境的能力，腸道定殖能力大大增強(qiáng)[14]，同時還克服了其不易培養(yǎng)和制劑化的缺陷，該融合子在厭氧和有氧環(huán)境中都能很好生長，可用于發(fā)酵乳、發(fā)酵肉制品、奶酪等食品的生產(chǎn)，也可用于L-乳酸、蛋白酶、淀粉酶等制劑的發(fā)酵生產(chǎn)，并能作為新一代乳酸菌或地衣芽孢桿菌整腸生制劑生產(chǎn)用的菌株。

通過本試驗(yàn)研究可知在常規(guī)培養(yǎng)條件下，CM培養(yǎng)基最有利于融合子的生長。CM、MRS和LB培養(yǎng)基的適宜初始pH值分別為6、7和5，BPM培養(yǎng)基初始pH值對融合子的生長繁殖影響不顯著。在CM培養(yǎng)基中，37℃更適于融合子生長，其他培養(yǎng)基的最適培養(yǎng)溫度均為35℃。除MRS培養(yǎng)基適合隔氧靜置培養(yǎng)外，其他3種培養(yǎng)基則配以通氧搖床培養(yǎng)方式。MRS培養(yǎng)基有利于融合子發(fā)酵產(chǎn)酸，第36小時時，乳酸生成量最高，達(dá)到2.30 g/L。

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