白永亮,凌志洲,林燕丹,夏雨
(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東佛山 528000;2.咀香園健康食品(中山)有限公司,廣東中山528437)
一個(gè)健康成人體內(nèi)的微生物細(xì)胞數(shù)量共有1014個(gè),其中大量的微生物寄居在腸道中[1-2]。乳酸桿菌通常定植在人或動(dòng)物的口腔和腸道中,屬于革蘭氏陽性無芽孢菌,一般為細(xì)長(zhǎng)的桿狀、大多呈鏈狀排列[3]。作為腸道內(nèi)最有利的一種益生菌,乳酸桿菌對(duì)人體的正常代謝活動(dòng)、營(yíng)養(yǎng)吸收起到非常重要的作用。乳酸桿菌可以通過其代謝產(chǎn)物降低腸道的pH值,從而抑制有害菌生長(zhǎng),具有減少體內(nèi)毒素,保護(hù)腸道黏膜,調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力,并預(yù)防一些胃腸道疾病的發(fā)生[4]。
人體超過50%人的飲食熱量來源于淀粉基質(zhì)食品,而淀粉基質(zhì)食品的質(zhì)量和數(shù)量直接影響到人體血糖與體內(nèi)代謝平衡??剐缘矸郏≧esistant starch,RS)的發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是最近二十年來碳水化合物在人體健康應(yīng)用方面的重大進(jìn)展[5]??剐缘矸塾址Q抗酶解淀粉及難消化淀粉,在人體小腸中不被消化吸收,在大腸內(nèi)被微生物利用發(fā)酵產(chǎn)酸,同時(shí)厭氧微生物降解有機(jī)質(zhì)產(chǎn)生代謝物用于菌體生長(zhǎng),引起微生物菌群的變化[5-7]。近年來的研究已初步證明,RS在大腸被生理性細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生多種短鏈脂肪酸(Short chain fatty acid,SCFA)和氣體,有助于降低大腸pH值,減少結(jié)腸癌發(fā)病率,抑制致病菌生長(zhǎng)和繁殖[8],同時(shí)促進(jìn)腸道內(nèi)益生菌的生長(zhǎng)和繁殖[9-10]。SCFAs對(duì)宿主能能產(chǎn)生重要的生理作用,如降低胞內(nèi)pH值,促進(jìn)礦物質(zhì)吸收,減少結(jié)腸內(nèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物膽汗酸的生成,以及影響大腸內(nèi)微生物菌群分布等[11-14]。在SCFAs中,丁酸是大腸細(xì)胞優(yōu)先的能量來源,能抑制腸癌細(xì)胞的擴(kuò)散[11],研究發(fā)現(xiàn)其與糖尿病、結(jié)腸癌和肥胖有關(guān)[5,15-20]。
抗性淀粉可分為4種類型:RS1是物理包埋淀粉,RS2天然抗性淀粉,RS3是回生淀粉和RS4是化學(xué)改性淀粉[21]。不同來源抗性淀粉在腸道中發(fā)酵情況不同,謝濤[22]等研究了4種淀粉樣品都能促進(jìn)短鏈脂肪酸(SCFAs)總量的增加,其中土豆回生淀粉(RS3)、交聯(lián)淀粉(RS4)與 Novelose 230(RS2)特別有利于促進(jìn)丁酸的生成。土豆回生淀粉(RS3)與交聯(lián)淀粉(RS4)能夠改善人體腸道菌群的分布、促進(jìn)SCFAs特別是丁酸的生成。青香蕉富含天然抗性淀粉,以其致密的顆粒結(jié)構(gòu)和晶體結(jié)構(gòu)而不能被人體小腸消化吸收,被認(rèn)為是第二類型的抗性淀粉(RS2)[23]。本試驗(yàn)?zāi)M香蕉抗性淀粉在小腸液、胃液中的消化過程,研究消化后香蕉抗性淀粉對(duì)乳酸桿菌的生長(zhǎng)繁殖影響以及乳酸桿菌對(duì)香蕉抗性淀粉的體外發(fā)酵作用,為益生菌制劑提供理論基礎(chǔ)。
青香蕉:廣州華工市場(chǎng);EMB瓊脂培養(yǎng)基、腸道增菌肉湯:青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;甲酸、乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)品,正己烷(色譜純)、乳酸檢測(cè)試劑盒:南京建成生物工程研究所。
5975-7890型氣相色譜儀:安捷倫科技有限公司;TDL-5-A離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;UV3010分光光度計(jì):日本日立公司;DGG-9070B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。
選擇采前8成~9成熟的青香蕉,徹底清洗干凈后去皮,切片并置于一定比例的VC、檸檬酸和亞硫酸氫鈉護(hù)色液中浸10 min,將香蕉肉與護(hù)色液按一定比例(1∶2)混合后打漿,4 000 r/min離心15 min。取沉淀在50℃烘干,打粉后過100目篩制得香蕉抗性淀粉,密封備用。
分別配制人工胃液和人工腸液。
取稀鹽酸(9.5%~10.5%)10 mL,加蒸餾水稀釋至體系pH值為1.5左右。然后按照1 g/100 mL的質(zhì)量濃度比加入胃蛋白酶,充分溶解后用孔徑0.20 μm微孔濾膜過濾除菌,即得人工胃液。
取磷酸二氫鉀6.8 g,用900 mL水溶解后,再用0.4%的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至6.8左右,然后分別加入10 g胰蛋白酶和10 g胰淀粉酶,充分溶解后,最后加水定容至1 000 mL,用孔徑0.20 μm微孔濾膜過濾除菌,備用。
采用Jenkins[24]提出的In-Vitro消化模型進(jìn)行消化模擬試驗(yàn)。分別稱取一定量的青香蕉淀粉浸入人工胃液、人工小腸液中,置于37℃水浴中振蕩。隔一定時(shí)間取樣,利用滲析袋模擬人體腸道來分離淀粉的消化產(chǎn)物,并將滲析袋內(nèi)的殘留物低溫(50℃以下)烘干后干燥保存?zhèn)溆谩?/p>
取健康大鼠糞便,將糞便樣品按質(zhì)量比1∶10的比例接入已滅菌的生理鹽水,充分震蕩,用四層無菌紗布過濾,制成樣品液,梯度稀釋后接種于EMB培養(yǎng)基,接種量為1 mL。于37℃厭氧培養(yǎng)48 h,選擇性培養(yǎng)乳酸桿菌。選擇性培養(yǎng)后,分別接種于9 mL腸道增菌肉湯(EE),37℃富集培養(yǎng)24 h。
取菌液1 mL,加入到裝有9 mL PBS緩沖液(pH7.4)的EP管中,混勻。然后,按菌落計(jì)數(shù)的方法梯度稀釋,取1 mL接種于添加有胃液和小腸液消化后香蕉抗性淀粉(20 g/L)的EMB選擇性培養(yǎng)基上,培養(yǎng)一定時(shí)間后菌落計(jì)數(shù),以不添加香蕉抗性淀粉為空白對(duì)照組,觀察菌落生長(zhǎng)狀況。
上述富集培養(yǎng)結(jié)束后,立即取菌液接種于含胃液和小腸液消化后的香蕉抗性淀粉的發(fā)酵培養(yǎng)基。分別厭氧培養(yǎng) 0 、4、8、12、16、20 h 后,測(cè)定其管內(nèi)溶液 pH值,同時(shí)將管內(nèi)培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移入已滅菌的15 mL聚乙烯管,加入0.5 mL 2%CuSO2溶液將菌殺死,于-20℃保存,測(cè)定短鏈脂肪酸和乳酸。
發(fā)酵液離心(3 000 r/min,15 min)。吸取5 mL上清液,14 mL 0.36 mol/L HClO4和 13.5 mL 1 mol/L NaOH,劇烈振蕩。加入2.5 mL 5 mol/L磷酸,劇烈振蕩。加入15 mL 1%濃H2SO4的甲醇溶液,70℃回流30 min。然后加入15 mL冷的正己烷提取。吸取1 μL有機(jī)層,上柱分析。
氣相色譜測(cè)定條件:載氣為N2,分流比80∶1,流速64 mL/min。采用 ZB-WAX,30 m×250 μm×0.25 μm。檢測(cè)器為FID,檢測(cè)器溫度為260℃。升溫程序:50℃保持5 min,然后以5℃/min升溫到100℃,再以20℃/min升溫到180℃,共運(yùn)行19 min。
將樣品發(fā)酵液、培養(yǎng)液用生理鹽水稀釋到適當(dāng)濃度,使測(cè)定絕對(duì)OD值(測(cè)定OD-空白OD)在0.05~0.35之間。
按表1加樣混勻后,于530 nm,1 cm光鏡,雙蒸水調(diào)零,測(cè)定各管吸光值。乳酸測(cè)定見表1。
表1 乳酸測(cè)定Table 1 Determination of lactic acid
圖1為香蕉抗性淀粉對(duì)乳酸桿菌生長(zhǎng)狀況的影響,香蕉抗性淀粉已經(jīng)過胃液和小腸液消化處理,空白對(duì)照培養(yǎng)基不添加香蕉抗性淀粉。
圖1 乳酸桿菌的生長(zhǎng)狀況Fig.1 The growth of lactobacillus
由圖1可看出,添加香蕉抗性淀粉后,乳酸桿菌的數(shù)量明顯增加。由此可知,香蕉抗性淀粉有利于乳酸桿菌的生長(zhǎng)繁殖,可作為其碳源利用。雖然目前關(guān)于抗性淀粉是如何促進(jìn)腸道菌群生長(zhǎng)的,還未知其分解機(jī)理。但根據(jù)我們前期的研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)腸道菌利用后的淀粉顆粒表面明顯形成了空洞,這證明了抗性淀粉確實(shí)作為腸道菌的唯一碳源被利用。此外,還有可能是前期的人工胃液和小腸液的處理,促進(jìn)了抗性淀粉可被利用的程度[26]。
乳酸桿菌富集培養(yǎng)后接種于含有消化后的香蕉抗性淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基,厭氧培養(yǎng) 0、4、8、12、16、20 h 后發(fā)酵液的pH值變化情況如圖2。
圖2 乳酸桿菌發(fā)酵液的pH值變化Fig.2 Changes in pH of lactobacillus fermentation
由圖2可知,乳酸桿菌在發(fā)酵過程中發(fā)酵液的pH值隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低,從0 h的7.2下降到20 h后的4.8??梢娙樗釛U菌能很好地利用香蕉抗性淀粉產(chǎn)酸,維持腸道的酸性環(huán)境。
胃液和小腸液消化后的香蕉抗性淀粉經(jīng)乳酸桿菌分別發(fā)酵 4、8、12、16、20 h 后,發(fā)酵液中各種短鏈脂肪酸含量和總酸含量的變化情況如圖3和圖4。
圖3 乳酸桿菌發(fā)酵液中SCFA含量的變化Fig.3 Changes of SCFA content of lactobacillus fermentation fluid
圖4 乳酸桿菌發(fā)酵液中SCFA的總酸含量變化Fig.4 The total acid content of SCFA in lactobacillus fermentation fluid
由圖3可知,發(fā)酵液中乙酸、丙酸和丁酸的含量均隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。甲酸在發(fā)酵4 h后基本穩(wěn)定在26 mmol/L左右;乙酸在發(fā)酵12 h時(shí)有明顯增加,12 h后增加速率減緩,20 h后達(dá)到29.23 mmol/L;丙酸含量在發(fā)酵過程中穩(wěn)步提升,發(fā)酵20 h后可達(dá)到33.28mmol/L;丁酸含量在發(fā)酵4h時(shí)達(dá)到21.88mmol/L,之后緩慢增加,發(fā)酵20 h后達(dá)到25.41 mmol/L;發(fā)酵液中短鏈脂肪酸的總酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)均有所增加,且增長(zhǎng)速率較為一致。發(fā)酵20 h后,總酸含量達(dá)到113.46 mmol/L??傮w來看,乳酸桿菌能夠發(fā)酵香蕉抗性淀粉產(chǎn)生短鏈脂肪酸,但產(chǎn)酸能力略低于雙歧桿菌[27]。且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),乙酸和丙酸的產(chǎn)量增長(zhǎng)較明顯,這與相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道結(jié)果基本一致[28-29]。
短鏈脂肪酸的種類和數(shù)量主要受發(fā)酵底物的種類、數(shù)量、降解速率以及腸道菌群及宿主生理狀態(tài)等因素的影響。不同酵解底物產(chǎn)生的短鏈脂肪酸總量和比例不同,對(duì)腸道生理功效也不相同。在機(jī)體內(nèi)大部分乙酸被吸收入血液,進(jìn)入肝臟的代謝,作為周邊組織的能源,是機(jī)體從小腸不能吸收的碳水化合物中獲取能量的主要途徑。丙酸經(jīng)結(jié)腸吸收后主要由肝臟代謝用作能源,并且能夠抑制膽固醇的合成。
經(jīng)胃液和小腸液消化后的香蕉抗性淀粉經(jīng)乳酸桿菌分別發(fā)酵 4、8、12、16、20 h 后,發(fā)酵液中乳酸含量變化情況如圖5。
圖5 乳酸桿菌發(fā)酵液中乳酸含量的變化Fig.5 The change of lactobacillus lactic acid content in the fermented liquid
發(fā)酵過程中乳酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢增加,增長(zhǎng)速率基本本不變。發(fā)酵20 h后,乳酸含量達(dá)到4.53 mmol/L。說明乳酸桿菌在發(fā)酵香蕉抗性淀粉時(shí)產(chǎn)生乳酸,但產(chǎn)量均在5 mmol/L以下,產(chǎn)乳酸的能力明顯低于雙歧桿菌[27]。乳酸產(chǎn)量是反映乳酸桿菌生理活性的重要指標(biāo),有研究發(fā)現(xiàn)乳酸可能是直腸菌群發(fā)酵利用香蕉淀粉產(chǎn)生的中間代謝物,能為腸道其它菌群提供能源[30]。
圖6為不同消化處理后香蕉抗性淀粉發(fā)酵產(chǎn)物(短鏈脂肪酸)的含量分析。
圖6 消化途徑對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響Fig.6 The effects of digestive pathways on fermentation products
由圖6可看出,4種樣品的發(fā)酵產(chǎn)物中總酸含量大小依次為:胃液和小腸液消化后>小腸液消化后>胃液消化后>原淀粉。分別經(jīng)胃液消化的香蕉淀粉和經(jīng)小腸液消化的香蕉抗性淀粉總酸產(chǎn)量相差不大,而經(jīng)胃液和小腸液消化的香蕉淀粉的總酸含量提高較為明顯,達(dá)到112.95 mmol/L。
我國(guó)香蕉資源豐富,且青香蕉富含天然抗性淀粉和膳食纖維,是制備高附加值抗性淀粉產(chǎn)品的良好來源。本試驗(yàn)結(jié)果表明,培養(yǎng)基中添加香蕉抗性淀粉后,乳酸桿菌的數(shù)量明顯增加,發(fā)酵20 h后,乳酸桿菌短鏈脂肪酸總酸含量達(dá)到113.46 mmol/L,乳酸含量達(dá)到4.53 mmol/L。說明香蕉抗性淀粉能夠促進(jìn)對(duì)乳酸桿菌的生長(zhǎng)繁殖;通過體外消化和發(fā)酵模擬的研究發(fā)現(xiàn),胃液和小腸液消化均使香蕉抗性淀粉發(fā)酵產(chǎn)物(短鏈脂肪酸)的含量比原淀粉高,表明胃液和小腸液的消化提高了香蕉抗性淀粉在大腸中的發(fā)酵作用,消化后的香蕉抗性淀粉更有利于腸道微生物的利用;隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),發(fā)酵產(chǎn)物中甲酸的含量變化不大,而乙酸、丙酸、丁酸、短鏈脂肪酸的總酸和乳酸含量均有提高。本文基于香蕉抗性淀粉的發(fā)酵特性,初步研究了香蕉抗性淀粉與乳酸桿菌的相互作用,但對(duì)香蕉抗性淀粉的酵解機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。而香蕉抗性淀粉如何通過發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸進(jìn)一步發(fā)揮相應(yīng)的生理功能也需進(jìn)一步研究。
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