劉雯雯，孫夢(mèng)瑩，劉麗娜，劉婷，妥彥峰

（大連工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連116034）

乳桿菌屬（Lactobacillus）細(xì)菌擁有悠久的人類食用歷史，在發(fā)酵蔬菜、發(fā)酵乳制品、發(fā)酵肉制品加工方面起著重要的作用。乳桿菌屬細(xì)菌利用食品物料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸、雙乙酰、胞外多糖可以改善發(fā)酵食品的風(fēng)味、提高發(fā)酵食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、改善發(fā)酵食品的質(zhì)地結(jié)構(gòu)，而乳桿菌胞外多糖在其中起到了重要的作用。胞外多糖是微生物在生長(zhǎng)代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外常滲于培養(yǎng)基的一類糖類化合物[1]。

自1982年日本Shino mi等報(bào)道乳酸菌胞外多糖（exopoly saccharides，EPS）具有抗腫瘤作用以來(lái)[2]，越來(lái)越多的人著手研究乳酸菌EPS的功能特性。有體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)Lactobacillus helveticus var.jugurti[3]、L.casei 01[4]作用結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29，可以抑制其增殖。HarounL等研究發(fā)現(xiàn)L.plantarum NRRL B-4496的EPS對(duì)5種源癌細(xì)胞喉癌細(xì)胞、腸道癌細(xì)胞、Caco-2、肝癌細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞具有明顯的抑制效果[5]。也有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)從開菲爾菌株中得到的EPS經(jīng)小鼠口服后對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有抑制作用[6]，Bifidobacterium bifidum的EPS對(duì)大鼠荷肝腫瘤亦有明顯抑瘤效果[7]。

某些乳桿菌的EPS具有抗氧化的作用[8]，而引起氧化的主要原因是大量活性氧的產(chǎn)生，因此，乳桿菌EPS的抗氧化作用主要是通過清除氧自由基作為指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。乳酸菌胞外多糖抗氧化作用的原理依然還有待探討，一般都是通過以下方式[9]：一是直接清除自由基本身，二是多糖分子會(huì)結(jié)合金屬離子進(jìn)而降低反應(yīng)的速率，減慢有害物質(zhì)的產(chǎn)生，抑制了自由基產(chǎn)生的速率，三是多糖分子可以間接提高抗氧化酶系的活力，加速了其他酶系的抗氧化作用[10]。

乳酸菌EPS具有廣闊的應(yīng)用前景，但產(chǎn)量通常較低是限制其工業(yè)化應(yīng)用的“瓶頸”因素。優(yōu)化發(fā)酵條件是提高乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量的重要途徑[11]。乳桿菌胞外多糖的產(chǎn)量受很多因素的影響，除與菌種的遺傳特性（控制多糖基因產(chǎn)生的酶系種類和活性）有關(guān)[12]，菌株培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分和環(huán)境條件也會(huì)影響乳酸菌EPS的合成，且在不同營(yíng)養(yǎng)條件和培養(yǎng)條件下合成的EPS的種類也不同[13]。研究表明，培養(yǎng)基成分主要包括碳源、氮源、碳氮比、金屬離子及無(wú)機(jī)鹽等[14]，環(huán)境條件包括培養(yǎng)基初始pH值、接種量、發(fā)酵溫度和時(shí)間等，通過優(yōu)化這些發(fā)酵條件均能顯著提高EPS的產(chǎn)量[15]。當(dāng)今社會(huì)人們?cè)絹?lái)越注重健康的生活方式，而胞外多糖的功效正符合這一社會(huì)需求。

本試驗(yàn)以大連工業(yè)大學(xué)大連益生菌功能特性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的L.plantarum-12乳桿菌菌株為研究對(duì)象，通過優(yōu)化碳源、發(fā)酵溫度和培養(yǎng)時(shí)間來(lái)提高胞外多糖產(chǎn)量，在此基礎(chǔ)上對(duì)胞外多糖影響人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖和清除DPPH自由基這兩項(xiàng)功能特性進(jìn)行研究。

1　材料與方法

1.1　材料與設(shè)備

1.1.1　材料

組織細(xì)胞：本試驗(yàn)所用人結(jié)腸癌腺細(xì)胞HT-29購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海典藏細(xì)胞庫(kù)。

試驗(yàn)菌株：本試驗(yàn)所采用的菌株Lactobacillus plantarum-12為大連工業(yè)大學(xué)大連市益生菌功能研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室所保藏菌株，分離自多寶魚腸道。

1.1.2　試劑

MTS試劑：普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；RPM1640培養(yǎng)液、青霉素和鏈霉素：美國(guó)Gibco公司；Tunel凋亡原位檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.3　設(shè)備

FD-1C-50型真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；5804R冷凍離心機(jī)：德國(guó)艾本德有限公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀Multiskan GO：美國(guó)Thermo公司；RV10自動(dòng)控制型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)IKA公司；二氧化碳培養(yǎng)箱：日本三洋電器公司；SHP-150生化培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；XSP-2C顯微鏡：上海精密儀器儀表有限公司。

1.2　方法

1.2.1　乳酸菌培養(yǎng)

L.plantarum-12以2%接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)24 h，傳代2次?；罨瘍纱魏缶o接著進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值至6.2。

1.2.2　L.plantarum-12發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖條件的優(yōu)化

1.2.2.1　碳源的優(yōu)化

利用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行菌株L.plantarum-12產(chǎn)胞外多糖條件的優(yōu)化，MRS培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10.0 g、牛肉10.0 g、酵母膏5.0 g、吐溫-80 1.0 mL、磷酸氫二鉀2.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、乙酸鈉5.0 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、蒸餾水1 000 mL；在此培養(yǎng)基中將碳源分別更換為蔗糖（10.0、20.0、40.0 g）、乳糖（10.0、20.0、40.0 g）、葡萄糖（10.0、20.0、40.0 g），121 ℃滅菌 15 min。

依照上述MRS培養(yǎng)基配方，設(shè)定不同的碳源及其濃度，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值至6.2。將在普通MRS液體培養(yǎng)基中活化第2代L.plantarum-12菌株以2%的接種量接于含有10 mL改變碳源濃度的3種MRS液體培養(yǎng)基的具塞試管中，置于37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h，不同的碳源濃度做3組平行試驗(yàn)。

1.2.2.2　發(fā)酵溫度的優(yōu)化

按照上述碳源的優(yōu)化結(jié)果，改良MRS培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值至6.2，將經(jīng)活化的第2代L.plantarum-12菌株以2%的接種量接于含有10 mL改良過的的MRS液體培養(yǎng)基的具塞試管中，分別置于30、37、43℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，每個(gè)培養(yǎng)溫度做3組平行試驗(yàn)。

1.2.2.3　培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化測(cè)定

按照上述試驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果，改良MRS培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值至6.2，將經(jīng)活化的第2代L.plantarum-12菌株以2%的接種量接于含有10 mL改良過的MRS液體培養(yǎng)基的具塞試管中，以優(yōu)化的溫度，分別培養(yǎng)24 h和48 h，每個(gè)培養(yǎng)時(shí)間做3組平行試驗(yàn)。

1.2.3　L.plantarum-12胞外多糖的提取

將各優(yōu)化條件下獲得的L.plantarum-12菌株培養(yǎng)液，利用冷凍離心機(jī)在4℃、12 677 r/min條件下離心5 min以除去菌體得到上清液。再將上清液用旋蒸儀蒸發(fā)濃縮至原體積的1/5，加三氯乙酸（trichloroaceticacid，TCA）至終濃度為4%后在室溫條件下磁力攪拌30 min。攪拌結(jié)束后，在4℃、13 363 r/min條件下離心15 min，除去蛋白得上清液，然后加3倍體積冷無(wú)水乙醇（4℃），在冰箱中4℃靜置24 h以使多糖完全沉淀。在4℃、13 363 r/min條件下離心20 min收集多糖，然后在得到的沉淀中加入適量的超純水使其溶解，之后分裝到透析袋中[16]，4℃超純水透析3 d且每8小時(shí)換一次水以便去除小分子，然后冷凍干燥得到粗多糖樣品，并用保鮮膜封口保存在干燥器中。

1.2.4　胞外多糖濃度的測(cè)定

參照魏紹云[17-18]所描述的試驗(yàn)方法，采用苯酚硫酸法測(cè)定各優(yōu)化條件下培養(yǎng)液中多糖濃度。將上述得到的10 mL多糖溶液，稀釋10倍，即吸取0.1 mL于試管中用蒸餾水補(bǔ)至1 mL，搖勻。加入0.5 mL 6%的苯酚，搖勻后迅速沿管壁加入2.5 mL濃硫酸，搖勻。室溫下靜置5 min，沸水浴15 min，冷卻至室溫。利用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各溶液的吸光度。每個(gè)菌株做3個(gè)平行的濃度測(cè)定，取其平均值，做方差分析。利用SPSS軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，比較他們的差異性，優(yōu)選最佳發(fā)酵條件。

1.2.5　細(xì)胞培養(yǎng)

參考李遠(yuǎn)翰[19]的方法，在RPM1640培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清（56℃滅活30 min），加入1%青霉素和鏈霉素。每?jī)商鞊Q液一次，將培養(yǎng)液全部吸凈，再加入4 mL培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶面積的80%、90%左右時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞的消化，進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

1.2.6　MTS法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰蛋白酶進(jìn)行消化，用培養(yǎng)液補(bǔ)足4 mL后，在普通光學(xué)顯微鏡下用臺(tái)盼藍(lán)染色的方法進(jìn)行計(jì)數(shù)（細(xì)胞液體積∶臺(tái)盼藍(lán)體積=9∶1）；設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照組、1個(gè)對(duì)照組和4個(gè)試驗(yàn)組，用培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞液，以1×104個(gè)/孔的濃度接種到96孔板中，每孔200 μL細(xì)胞液，然后放到37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，試驗(yàn)組加入用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋到不同濃度（分別為50、100、250、500 μg/mL）的乳酸菌胞外多糖粗糖，每組做6個(gè)復(fù)孔，每孔200 μL糖液，空白對(duì)照組和對(duì)照組每孔加入200 μL培養(yǎng)液，然后置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)48 h后，吸棄培養(yǎng)液并用PBS洗2次，每孔加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液和20 μL MTS試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)其吸光度[20-21]。重復(fù)3次試驗(yàn)。HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式如下：

式中：A為各組的吸光度值。

1.2.7　細(xì)胞凋亡測(cè)定

本試驗(yàn)選用Tunel凋亡原位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)乳桿菌胞外多糖引起的HT-29細(xì)胞凋亡。首先將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以105個(gè)/mL的濃度接種2 mL到6孔板中的細(xì)胞爬片上，24 h后加入乳酸菌胞外多糖（濃度分別為 50、100、250、500 μg/mL）處理 48 h。之后先將培養(yǎng)好的細(xì)胞爬片晾干，再于固定液中室溫固定1 h，之后用PBS漂洗3次，每次5 min。再將爬片浸入封閉液中室溫封閉10 min，之后用PBS漂洗3次，每次5min，然后把處理好的樣本浸入通透液，冰上滲透2 min。最后進(jìn)行標(biāo)記和顯色，先把與處理好的樣本PBS漂洗2次，每次5 min，然后把周圍的水用濾紙吸干。處理完成后，每個(gè)樣本滴加50 μL TdT反應(yīng)液并加蓋玻片37℃避光濕潤(rùn)反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后PBS漂洗3次，每次5 min。吸干樣本周圍的液體，再滴加50 μL Streptavidin-HRP工作液，加蓋玻片37℃濕潤(rùn)避光反應(yīng)30 min，然后PBS漂洗3次，之后吸干液體。接下來(lái)向處理好的樣本中滴加50 μL～100 μL DAB工作液，室溫孵育30 min后PBS漂洗30 min，吸干PBS殘留液。之后先用4%多聚甲醛固定10 min，蒸餾水洗滌2次，每次2 min，然后甲基綠染色10 min，染色完成后用蒸餾水洗滌2次，再用95%乙醇脫水5 s。最后光學(xué)顯微鏡下分別觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.8　乳酸菌胞外多糖抗氧化活性的測(cè)定

以DPPH自由基的清除能力為抗氧化活性指標(biāo)。稱取干燥的L.plantarum-12菌株粗多糖，配置濃度分別為0.10、0.30、0.50mg/mL的多糖溶液。向1 mL配置好的DPPH乙醇溶液中加入1 mL上述多糖溶液。1 mL PBS溶液中1 mL樣品溶液作對(duì)照組。另取1 mLDPPH乙醇溶液加入到1 mL PBS溶液中，振蕩搖勻。避光反應(yīng)30 min。在4 000 r/min常溫條件下離心15 min，取上清液，用酶標(biāo)儀測(cè)定上清液在517 nm處的吸光度[22-23]。多糖溶液對(duì)DPPH自由基的清除率計(jì)算公式：

式中：Ac為DPPH+PBS的吸光度值；Ai為DPPH和多糖溶液的吸光度值；Aj為PBS和多糖溶液的吸光度值。

1.2.9　數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次或以上，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并經(jīng)SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用Duncan’s檢驗(yàn)，p＜0.05表示差異顯著。

2　結(jié)果與討論

2.1　乳桿菌胞外多糖發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.1.1　碳源的優(yōu)化測(cè)定

碳源的種類一直是公認(rèn)的影響乳桿菌產(chǎn)胞外多糖的重要因素的之一，培養(yǎng)基中碳源的不同會(huì)導(dǎo)致乳桿菌的胞外多糖產(chǎn)量[24-27]。目前的主流碳源有葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、果糖等，本次碳源優(yōu)化試驗(yàn)，選用葡萄糖、乳糖、蔗糖作為不同的碳源來(lái)測(cè)定它們對(duì)乳桿菌胞外多糖產(chǎn)量的影響。

為了很好的確定其發(fā)酵條件的最優(yōu)組合，本次試驗(yàn)選用碳源種類、碳源濃度兩個(gè)因素，每個(gè)因素分為3個(gè)水平，碳源分別改用蔗糖、乳糖、葡萄糖，碳源濃度分別取1%、2%、4%，進(jìn)一步確定碳源種類和碳源濃度。利用苯酚硫酸法測(cè)得發(fā)酵液中多糖溶液吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算多糖的產(chǎn)量，結(jié)果如圖1所示。

圖1　不同碳源種類、碳源濃度的EPS產(chǎn)量Fig.1　EPS production with different carbon source types and carbon source concentrations

當(dāng)碳源為蔗糖、其濃度為40 g/L時(shí)，胞外多糖為0.05 g，顯著高于其它碳源產(chǎn)EPS濃度。從印度發(fā)酵飲料（Kyiad pyrsi）分離得到的菌株 Leuconstoc lactis[24]，當(dāng)碳源為蔗糖時(shí)，EPS產(chǎn)量最高；對(duì)于L.kefiranofaciens[25]，Lactobacillus strain A[26]當(dāng)碳源為乳糖時(shí)，EPS產(chǎn)量最高；而對(duì)于菌株YM-2，其最優(yōu)碳源為葡萄糖[27]。以此說(shuō)明優(yōu)勢(shì)碳源的利用具有菌株差異性，不同的菌株的最適碳源也都不相同，并沒有適合所有桿菌的最適碳源。根據(jù)本次試驗(yàn)結(jié)果可以確定，L.plantarum-12菌產(chǎn)胞外多糖的最適碳源為蔗糖。

2.1.2　培養(yǎng)溫度的優(yōu)化測(cè)定

以蔗糖為MRS培養(yǎng)基的碳源，從試驗(yàn)2.1.1可以得出蔗糖濃度為20 g/L和40 g/L時(shí)，EPS產(chǎn)量均較高，結(jié)合原料用量節(jié)省和試驗(yàn)結(jié)果兩方面考慮，接下來(lái)的試驗(yàn)碳源濃度選用20 g/L。L.plantarum-12菌株接種在上述MRS培養(yǎng)基中，在不同溫度條件下培養(yǎng)24 h，利用苯酚硫酸法測(cè)多糖溶液吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算多糖的產(chǎn)量，結(jié)果如圖2所示。

培養(yǎng)溫度為43℃時(shí)，L.plantarum-12菌株EPS的產(chǎn)量的最低，為0.034 03mg/mL；30℃時(shí)多糖的產(chǎn)量最高，達(dá)到0.045 70mg/mL。在3種不同溫度下，多糖的產(chǎn)量存在顯著差異，說(shuō)明發(fā)酵溫度是影響多糖產(chǎn)量的原因。

圖2　不同溫度下的EPS產(chǎn)量Fig.2　EPS production at different temperatures

Mozzi等[28]研究發(fā)現(xiàn)在30℃時(shí)德式乳桿菌保加利亞嗜酸乳桿菌和嗜熱乳桿菌產(chǎn)EPS的量達(dá)到最大。Gamar等[29]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度在25℃～37℃變化時(shí)，在開始的5 h內(nèi)，可提高乳桿菌鼠李糖亞種C83產(chǎn)EPS的量。Grobben等[30]發(fā)現(xiàn)德式乳桿菌保加利亞亞種NCFB2772在脫脂乳及限制培養(yǎng)基上產(chǎn)胞外多糖的最適溫度（45℃～48℃）高于生長(zhǎng)最適溫度（37℃～42℃）。從這些文獻(xiàn)可以發(fā)現(xiàn)，不同菌株的最適發(fā)酵溫度也都不相同，而且同一菌株的最適產(chǎn)胞外多糖的溫度和其自身生長(zhǎng)的最適溫度也不同。

2.1.3　培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化測(cè)定

以蔗糖為MRS培養(yǎng)基碳源，濃度為20 g/L，培養(yǎng)溫度為30℃。L.plantarum-12菌株活化2代并擴(kuò)大培養(yǎng)，利用苯酚硫酸法測(cè)定發(fā)酵液中多糖溶液吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算多糖的產(chǎn)量，結(jié)果如圖3所示。

圖3　不同培養(yǎng)時(shí)間下的EPS產(chǎn)量Fig.3　EPS production at different culture times

乳桿菌胞外多糖的生物合成還受到培養(yǎng)時(shí)間的影響。本研究在單因素試驗(yàn)中將時(shí)間條件確定為24 h和48 h。其他條件設(shè)置為蔗糖20g/L，培養(yǎng)溫度為30℃。由圖3可知，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)植物乳桿菌EPS的生物合成具有重要影響。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間在24 h時(shí)，乳桿菌EPS生物合成量較低；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到48 h后，EPS的生物合成顯著增加。這說(shuō)明不同的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)L.plantarum-12的胞外多糖的生物合成影響不同，本次試驗(yàn)得到的最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間為48 h。

郝魯江等[31]將發(fā)酵條件修改為培養(yǎng)時(shí)間33.8 h，得到EPS-PⅡ產(chǎn)量平均值為2.62 g/L。吳錦羽等[32]發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌ST-L134-7-P的EPS在培養(yǎng)時(shí)間小于48 h時(shí)，產(chǎn)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而積累增多，而48 h之后，EPS的產(chǎn)量開始下降并逐漸平穩(wěn)。產(chǎn)胞外多糖乳酸菌在食品工業(yè)中前景廣闊。然而，乳酸菌胞外多糖的產(chǎn)量一般都比較低（50mg/L～425mg/L）[33]。乳酸菌胞外多糖的產(chǎn)量與菌種有密切關(guān)系，菌株不同，胞外多糖合成能力差別大。同一菌株發(fā)酵條件不同，胞外多糖的產(chǎn)量也有明顯差異。但因?yàn)镋PS的功效越來(lái)越受人們關(guān)注，其能否在工業(yè)上大量生產(chǎn)決定了它的實(shí)用價(jià)值，研究表明，通過優(yōu)化碳源、氮源、pH值、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等都能顯著提高乳酸菌胞外多糖的產(chǎn)量[34]。

從上述結(jié)果可知，L.plantarum-12乳桿菌EPS產(chǎn)量的最佳條件為：碳源種類為蔗糖，碳源濃度40 g/L，培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)時(shí)間48 h。因此本試驗(yàn)以此條件下的最優(yōu)組合進(jìn)行一次粗多糖的提取，通過透析凍干，獲得粗多糖，經(jīng)測(cè)定計(jì)算可知粗多糖提取完畢后得到的終產(chǎn)品有最大的EPS產(chǎn)量為50mg/L。

2.2　L.plantarum-12的EPS對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的影響

利用菌株L.plantarum-12不同濃度的EPS（50、100、250、500 μg/mL）作用于 HT-29 細(xì)胞，處理 48 h，采用MTS法測(cè)定HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)率，結(jié)果如圖4所示。

圖4　Lactobacillus plantarum 12 EPS抑制HT-29細(xì)胞增殖Fig.4　Inhibition effect of EPS from Lactobacillus plantarum 12 in HT-29 cells

EPS對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的抑制率隨著EPS濃度的增加而增大，在500 μg/mL時(shí)，抑制率可達(dá)32%，顯著高于（p＜0.05）其它濃度EPS處理的抑制率。采用Tunel法[35]，繼續(xù)驗(yàn)證菌株L.plantarum-12不同濃度的EPS是否通過引起HT-29細(xì)胞凋亡。在HT-29細(xì)胞被不同濃度的EPS處理48 h后，用Tunel凋亡檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞的凋亡情況。不同濃度EPS誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞的凋亡見圖5。

圖5　不同濃度EPS誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞的凋亡Fig.5　Induction of apoptosis of HT-29 cells by EPS at different concentrations

如圖5所示，對(duì)照組每100個(gè)細(xì)胞中凋亡數(shù)為2.7個(gè)。相比之下，隨著EPS作用濃度的增大，細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增多，分別為每100個(gè)細(xì)胞中有13.2、16.3、32.7和50.3個(gè)凋亡細(xì)胞。在500 μg/mL時(shí)，細(xì)胞凋亡數(shù)量在每100個(gè)細(xì)胞中可達(dá)50.3個(gè)，顯著高于其它3個(gè)濃度（p＜0.05）。由此可知，L.plantarum-12的EPS誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡與EPS濃度大小有關(guān)，而且，濃度越大凋亡效果越明顯。

細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是一件被動(dòng)的過程，而是主動(dòng)過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用[36]。E－waschuk 等報(bào)道了 VSL3、L.acidophilus、L.bulgaricus、L.casei、L.plantarum、B.breve、B.infantis、B.longum 和Streptococcus thermophil可降低癌細(xì)胞HT-29和Caco-2細(xì)胞的存活率并誘導(dǎo)其凋亡[37]。Liu Chuting等的研究結(jié)果表明L.casei胞外多糖能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的增殖，還可以降低4-NQO對(duì)正常腸細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用[4]。本試驗(yàn)也證實(shí)了乳酸菌EPS可以誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡。

2.3　乳酸菌胞外多糖的抗氧化測(cè)定

DPPH·是一種穩(wěn)定合成的有機(jī)自由基。它的穩(wěn)定性主要來(lái)自共振穩(wěn)定作用及三個(gè)苯環(huán)的空間障礙，而使夾在其中氮原子上的不成對(duì)電子不能發(fā)揮其應(yīng)有的電子成對(duì)作用。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，其孤對(duì)電子在517 nm附近有強(qiáng)吸收和乙醇容易呈紫色[38]。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，由于與其單電子配對(duì)而使其吸收消失或減弱，其褪色程度與其接受的電子數(shù)呈定量關(guān)系，因而測(cè)定吸收減弱的程度可以評(píng)價(jià)自由基清除劑的活性[39]。蔡秋杏[40]研究發(fā)現(xiàn)分離自腌干魚的乳酸菌所產(chǎn)生的胞外多糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力。熊強(qiáng)等[41]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌Z22胞外多糖分離純化后的酸性多糖EPS-S對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）的清除率可達(dá)27.75%。本試驗(yàn)采用DPPH清除試驗(yàn)對(duì)L.plantarum-12的EPS進(jìn)行抗氧化測(cè)定，結(jié)果見圖6。

圖6　Lactobacillus plantarum-12胞外多糖的抗氧化性Fig.6　Antioxidant activity of the EPS of Lactobacillus plantarum-12

由圖6可知，隨著EPS濃度升高，DPPH自由基清除率增加，在濃度為0.5mg/mL時(shí)可達(dá)51.54%。3結(jié)論

本研究通過單因素試驗(yàn)分析了Lactobacillus plantarum-12乳桿菌胞外多糖生物合成的最佳培養(yǎng)條件，得到的優(yōu)化條件為：碳源種類為蔗糖，碳源濃度40 g/L，培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)時(shí)間48 h，此條件下乳桿菌的EPS產(chǎn)量為50mg/L。

本研究中菌株L.plantarum-12的EPS對(duì)HT-29細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用，且與EPS濃度大小有關(guān)，隨著EPS濃度的增大，對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的抑制率增加，細(xì)胞凋亡量也顯著增加。L.plantarum-12胞外多糖的抗氧化性也隨EPS濃度升高而顯著增加。

參考文獻(xiàn)：

[1]丹彤,王俊國(guó),張和平.乳酸菌胞外多糖的結(jié)構(gòu),生物合成及其應(yīng)用[J].食品科學(xué),2013,34(7):335-339

[2]Shiomi M,Sasaki K,Murofushi M,et al.Antitumor activity in mice of orally administered polysaccharide from Kefir grain.[J].Jpn J Med Sci Biol,1982,35(2):75-80

[3]Oda M,Hasegawa H,Komatsu S,et al.Anti-tumor Polysaccharide from Lactobacillus sp.[J].Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan,2006,47(7):1623-1625

[4]Liu C T,Chu F J,Chou C C,et al.Antiproliferative and anticytotoxic effects of cell fractions and exopolysaccharides from Lactobacillus casei 01[J].Mutation Research,2011,721(2):157-162

[5]Haroun M B,Refaat M B,El-Menoufy A H,et al.Structure analysis and antitumor activity of the exopolysaccharide from probiotic Lactobacillus plantarum NRRL B-4496 In vitro and In vivo[J].Journal of Applied Sciences Research,2013,9(1):425-434

[6]Ohta T,Nakatsugi S,Watanabe K,et al.Inhibitory effects of Bifidobacterium-fermented soy milk on 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine-induced rat mammary carcinogenesis,with a partial contribution of its component isoflavones[J].Carcinogenesis,2000,21(5):937-941

[7]Bermudes D,Zheng L M,King I C.Live bacteria as anticancer agents and tumor-selective protein delivery vectors[J].Current Opinion in Drug Discovery&Development,2002,5(2):194-199

[8]郭曉娜,郭雅玲,廖澤明,等.烏龍茶抗氧化活性研究態(tài)勢(shì)[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2014(12):4115-4120

[9]孟祥升,李博.副干酪乳桿菌及其胞外多糖的抗氧化性研究[J].食品科技,2012(9):48-53

[10]李景艷.乳酸菌胞外多糖的抗氧化活性及其結(jié)構(gòu)[D].無(wú)錫:江南大學(xué),2013

[11]張巖春,李盛鈺,張春紅,等.產(chǎn)胞外多糖植物乳桿菌C88發(fā)酵條件優(yōu)化[J].中國(guó)乳品工業(yè),2010,38(7):18-21

[12]Ruasmadiedo P,Hugenholtz J,Zoon P.An overview of the functionality of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria.[J].International Dairy Journal,2002,12(2/3):163-171

[13]Welman A D,Maddox I S.Exopolysaccharides from lactic acid bacteria:perspectives and challenges[J].Trends in Biotechnology,2003,21(6):269-74

[14]Pan D,Mei X.Antioxidant activity of an exopolysaccharide purified from Lactococcus lactis subsp.Lactis 12[J].Carbohydrate Polymers,2010,80(3):908-914

[15]劉俊.多粘類芽孢桿菌胞外多糖的發(fā)酵條件、結(jié)構(gòu)、化學(xué)修飾及其抗氧化活性的研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2010

[16]Zhang L,Liu C,Li D,et al.Antioxidant activity of an exopolysaccharide isolated from Lactobacillus plantarum C88[J].International Journal of Biological Macromolecules,2013,54(1):270

[17]魏紹云,齊慧玲,王繼倫,等.苯酚——硫酸法測(cè)定白及多糖[J].天津化工,2000,3:35-36

[18]王文平,郭祀遠(yuǎn),李琳,等.苯酚-硫酸法測(cè)定野木瓜中多糖含量的研究[J].食品科學(xué),2007,28(4):276-279

[19]李遠(yuǎn)翰.PDT誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡和壞死的實(shí)驗(yàn)研究[D].長(zhǎng)沙:中南大學(xué),2013

[20]桑亞秋,張根義,李文竹.白藜蘆醇對(duì)玉米赤霉烯酮毒素致人胚腎HEK293細(xì)胞毒性的干擾作用[J].現(xiàn)代食品科技,2016(10):1-8

[21]Sun J,Liu R H.Cranberry phytochemical extracts induce cell cycle arrest and apoptosis in human MCF-7 breast cancer cells[J].Cancer Letters,2006,241(1):124-134

[22]Yin J Y,Nie S P,Chao Z,et al.Chemical characteristics and antioxidant activities of polysaccharide purified from the seeds of Plantago asiatica L[J].Journal of the Science of Food&Agriculture,2010,90(2):210-217

[23]Wang C H,Lai P,Chen M E,et al.Antioxidative capacity produced by Bifidobacterium-and Lactobacillus acidophilus-mediated fermentations of konjac glucomannan and glucomannan oligosaccharides[J].Journal of the Science of Food&Agriculture,2010,88(7):1294-1300

[24]Joshi S R,Koijam K.Exopolysaccharide Production by a Lactic Acid Bacteria,Leuconostoc lactis,Isolated from Ethnically Fermented Beverage[J].National Academy Science Letters,2014,37(1):59-64

[25]Cheirsilp B,Shimizu H,Shioya S.Modelling and optimization of environmental conditions for kefiran production by Lactobacillus kefiranofaciens[J].Applied Microbiology&Biotechnology,2001,57(5/6):639-646

[26]Desai K M,Akolkar S K,Badhe Y P,et al.Optimization of fermentation media for exopolysaccharide production from Lactobacillus plantarum,using artificial intelligence-based techniques[J].Process Biochemistry,2006,41(8):1842-1848

[27]司天昭,柳陳堅(jiān),秦曉萌,等.植物乳桿菌YM-2菌株胞外多糖生物合成工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué),2017,38(10):24-30

[28]Mozzi F,Oliver G,Giori G S D,et al.Influence of temperature on the production of exopolysaccharides by thermophilic lactic acid bacteria[J].Milchwissenschaft-milk Science International,1995,50(2):80-82

[29]Gamar-Nourani L,Blondeau K,Simonet J M.Influence of culture conditions on exopolysaccharide production by Lactobacillus rhamnosus strain C83[J].Journal of Applied Microbiology,1998,85(4):664-672

[30]Grobben G J,Sikkema J,Smith M R,et al.Production of extracellular polysaccharides by Lactobacillus delbrueckii spp.bulgaricus NCFB 2772 grown in a chemically defined medium[J].Journal of Applied Bacteriology,1995,79(1):103-107

[31]郝魯江,范秋蘋,張曉飛,等.海洋細(xì)菌Pseudoalteromonas issachenkonii產(chǎn)胞外多糖EPSPⅡ的發(fā)酵工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2015,36(23):256-260

[32]吳錦羽,林偉鋒,陳中.響應(yīng)面法優(yōu)化嗜熱鏈球菌產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)條件[J].食品科技,2015(7):18-22

[33]于靜,曾小群,王鴻飛,等.高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選及其發(fā)酵條件優(yōu)化[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2015,15(2):93-98

[34]馮美琴,邢家溧,張琦,等.植物乳桿菌胞外多糖發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].食品科學(xué),2011,32(23):215-219

[35]Xue J,Tong L,Rui H L.2α-Hydroxyursolic Acid Inhibited Cell Proliferation and Induced Apoptosis in MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through the p38/MAPK Signal Transduction Pathway[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry,2016,64(8):1806

[36]董淮海.讓腫瘤自然凋亡[M].太原:山西科學(xué)技術(shù)出版社,2014

[37]Ewaschuk J B,Walker J W,Diaz H,et al.Bioproduction of conjugated linoleic acid by probiotic bacteria occurs in vitro and in vivo in mice[J].Journal of Nutrition,2006,136(6):1483

[38]Naik G H,Priyadarsini K I,Satav J G,et al.Comparative antioxidant activity of individual herbal components used in Ayurvedic medicine[J].Phytochemistry,2003,63(1):97

[39]孫海紅.三株海洋微生物中胞外多糖的分離、結(jié)構(gòu)和抗氧化活性研究[D].青島:中國(guó)海洋大學(xué),2009

[40]蔡秋杏,吳燕燕,李來(lái)好,等.來(lái)源于腌干魚的乳酸菌中抗氧化酶及胞外多糖研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2017,41(6):952-961

[41]熊強(qiáng),王凱,王延斌.植物乳桿菌的功能評(píng)價(jià)[J].生物加工過程,2016,14(6):46-53