李 鶴，孫勝悅，黃元龍，楊文艷,2,楊連玉,2*

(1.吉林農業(yè)大學動物科學技術學院，吉林長春 130118；2.吉林省動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，吉林長春 130118)

銅參與包括以糖類、氨基酸、脂肪酸等營養(yǎng)素形式等存在，在細胞呼吸作用下釋放能量，并將多余的能量儲存于腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)中，ATP用于酶催化合成、細胞跨膜運輸和蛋白質降解。銅維持生命不僅需要細胞中銅的穩(wěn)態(tài)調節(jié)，而且需要銅轉運到與其相應的配體中，避免氧化應激反應(Oxidative stress reaction,ROS)。銅穩(wěn)態(tài)的調節(jié)需通過有效、正確地運輸和儲存金屬，來滿足其在細胞、器官以及個體的需要。此外，在哺乳動物的整個生命周期中，不同的發(fā)育階段，器官對銅的需求量也不同。實際上，肝臟銅含量最高，其次是大腦、心臟和腎臟，肌肉和骨骼銅含量最低。銅的排泄,一部分通過膽汁,由糞便排出,另一部隨血液經(jīng)腎臟濾過,由尿液排出[1]。腎臟既是銅的排泄器官也是儲銅器官。有研究報道腎臟是僅次于肝臟的第二儲銅器官,腎臟的銅含量隨著飼糧銅添加水平的增加而增加[2]。本文將闡述銅在腎臟細胞及組織中的吸收、儲存和排泄的轉運過程，以揭示哺乳動物機體銅穩(wěn)態(tài)調節(jié)機制。

1 腎臟細胞銅攝入與其胞內的穩(wěn)態(tài)

1.1 銅的攝入與腎臟細胞內銅穩(wěn)態(tài)

腎臟作為銅排泄的器官，在銅穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了一定作用。無論是缺銅或銅積累條件，腎臟會調控銅的含量來維持銅穩(wěn)態(tài)。腎臟中腎小球的濾過作用可維持機體的滲透壓及血壓平衡，而腎小管和集合管的重吸收與分泌作用可進行物質跨模轉運。動物通過日糧攝取銅后，進入血液，經(jīng)過腎小管和集合管的重吸收作用，與多種銅轉運因子結合，將銅轉運至小管液中，最終隨著尿液排出體外。腎小管上皮細胞是銅轉運蛋白(CTR1)轉運的主要場所，髓袢細胞為銅轉運P型ATP酶(ATP7A,ATP7B)的主要場所，在集合管細胞中細胞色素氧化酶與銅進行結合的主要場所。研究發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞銅穩(wěn)態(tài)平衡不僅依靠CTR1、ATP7A、ATP7B之間相互調節(jié)轉運[3]，而且需要兩種重要的銅伴侶蛋白，即抗氧化蛋白1(ATOX1)、超氧化物歧化酶伴侶蛋白(CCS)，以及在腎細胞中特異性不強的銅轉運蛋白(CTR2)，還有在腎臟銅穩(wěn)態(tài)中降低銅毒性具有重要作用的金屬硫蛋白(MT)。

1.2 銅在腎臟細胞內儲存、轉運及胞內的銅穩(wěn)態(tài)

對哺乳動物而言，銅攝取可維持其正常的生長發(fā)育，CTR1對銅吸收具有關鍵作用。研究表明，適當水平的銅可維持雄鼠的精子發(fā)生，在銅過量時CTR1可轉運銅至生精小管以維持細胞銅的穩(wěn)態(tài)[4]。CTR1活性受到其表達位置和胞內銅濃度的調控。CTR1定位于細胞質內的囊泡中，并隨著銅濃度的升高產(chǎn)生胞吞作用。付世鑫等研究證實在銅添加量在7.8 μmoL/L～62.5 μmoL/L的豬腎PK-15細胞中，Ctr1mRNA 表達呈雙相反應[5]。而在銅濃度過高時，CTR1蛋白會通過加速銅轉運調節(jié)，來維持機體內銅水平的穩(wěn)定。Cheng J等[6]在在魚類腸道吸收和轉運銅中發(fā)現(xiàn)，魚的腸上皮細胞隨著銅濃度的升高，CTR1蛋白降解加快。銅通過血液進入腎小管上皮細胞，CTR1轉運銅來調節(jié)腎小管上皮細胞胞內銅穩(wěn)態(tài)。低銅時，CTR1氨基末端蛋氨酸修飾后，內化至細胞質膜以攝取外周銅。高銅時，CTR1分布在腎小管細胞胞內，降低胞內銅的轉入，并以流動性胞內銅池的形式貯存銅[7]。CTR1在近端和遠端腎小管上皮細胞中表達，并通過腎小球濾過的原尿將銅循環(huán)回到血液，此時腎臟CTR1水平升高，全身銅含量降低，這可能有助于尿銅的吸收[8]?？傊珻TR1分布在腎臟細胞不同的亞細胞器上，不同的功能分布促使細胞內環(huán)境的穩(wěn)定。

銅轉運蛋白CTR2，與CTR1結構類似，有3個跨膜結構域，與哺乳動物CTR1的作用的結構、生理功能相反，對CTR2的作用報道較少。CTR2在哺乳動物細胞轉運銅從囊泡進入細胞質，CTR2在細胞質膜對銅轉運親和力較低。研究發(fā)現(xiàn)，缺少CTR2 mRNA細胞中唐氏綜合征發(fā)病率增加，這表明CTR2可能調解細胞的吞噬作用[9]。雖然CTR2已被證實在銅轉運中發(fā)揮一定作用，但是關于CTR1與CTR2在銅穩(wěn)態(tài)細胞模型中是否有協(xié)同調節(jié)的機制并不明確，有待進一步的研究。

金屬硫蛋白(MT)是腎臟銅吸收的另一個轉入因子，雖然能攜帶多種二價金屬離子(Fe2+、Cu2+、Zn2+等)，但Cu2+與其他二價金屬相比與MT結合更加密切。隨著銅濃度的增加，腎組織MT含量增高，這可能對腎臟組織細胞起到保護作用[10]。而在銅缺乏時，缺乏MT的小鼠胚胎成纖維細胞存活率降低,這揭示了MT在細胞中是銅的一種儲存蛋白，在銅缺乏時可以發(fā)揮作用。以上表明腎臟銅穩(wěn)態(tài)中，MT在銅攝取方面具有一定的促進和調節(jié)作用。

1.3 銅在腎臟細胞內儲存、轉運及胞內銅穩(wěn)態(tài)的可持續(xù)性

進入細胞的銅能立即與其相關小肽和蛋白結合，從而達到消除或抑制銅自由基高毒性的作用。在銅過量時，可通過銅螯合物調控在銅儲存發(fā)揮生理作用[11]。為此，相關研究大量報道了這些輔助因子即銅伴侶蛋白，銅伴侶蛋白對銅具有較高的親和性。在某些非特定反應中，銅通過銅結合蛋白之間的相互作用來確保銅離子傳遞到適合的靶細胞器，從而達到了細胞內銅的貯存、自由基清除，最終形成了腎細胞的銅穩(wěn)態(tài)。

1.3.1 細胞質中銅-CCS-SOD1調節(jié) 銅離子進入腎臟細胞，通過銅轉運蛋白將銅轉運到特定的銅伴侶蛋白和其他配體(如谷胱甘肽或MT)中。銅伴侶蛋白CCS，以二聚體的形式存在。CCS單體由249個氨基酸殘基組成，包含了3個功能結構域。CCS能夠將銅離子轉運到超氧化物歧化酶1(SOD1)上，促使二硫鍵的形成并激活SOD1。CCS需要Cu、Zn將銅傳遞到SOD1，細胞內銅穩(wěn)態(tài)調節(jié)通過CCS翻譯調節(jié)的，其表達水平與哺乳動物26S蛋白酶有關。在銅缺乏和細胞內銅升高時，CCS水平降低，導致SOD1蛋白水平表達升高。雖然CCS的調節(jié)不直接影響SOD1蛋白表達，但對其酶活具有調節(jié)作用。研究表明,CCS基因敲除的小鼠，SOD的酶活顯著降低到10%～30%[12]。這表明CCS對SOD1的激活是非常重要的，CCS的獨立通路實現(xiàn)將銅直接傳遞到SOD1。研究表明,對于缺乏CCS的秀麗線蟲中，CCS的產(chǎn)生會直接影響銅-谷胱甘肽復合物形成[13]。

1.3.2 細胞質中銅-Atox1調節(jié) 與酵母中銅伴侶銅轉運蛋白(Atx1-Ccc2)轉運銅到分泌器官作用相似，同源哺乳動物銅伴侶蛋白(Atox1)轉運銅到ATP酶上(ATP7A和ATP7B)。小鼠缺乏Atox1會使胎盤中的銅轉運降低，導致新生仔鼠腦和肝臟銅缺乏。缺乏Atox1還會導致具有銅依賴性細胞色素氧化酶和酪氨酸酶活性的降低。缺乏Atox1的新生兒也表現(xiàn)出圍產(chǎn)期及出生后生長嚴重受損，這表明Atox1在胎盤及全身的ATP7A/B的介導銅轉運中發(fā)揮關鍵作用[14]。除了銅伴侶在細胞質中的作用外,Atox1也可以作為一個轉錄因子，在高銅的條件下從細胞核轉入，并與細胞增殖有關的其他基因(如細胞周期蛋白D1)結合，刺激胞外編碼超氧化物歧化酶(SOD)蛋白家族成員SOD3基因的表達[15]。Atox1可調節(jié)銅并ATP7A/B運輸銅到細胞外的分泌腔。在高銅條件下，Atox1在細胞核中積累并激活靶基因進行轉錄。

1.3.3 線粒體中銅-CCO調節(jié) 在哺乳動物中，細胞色素氧化酶(CCO)是線粒體呼吸鏈復合物Ⅳ，由13個亞基組成，其中10個由核基因編碼，3個由線粒體基因編碼。與酵母相同，銅轉運到環(huán)氧化物水解酶(Cox1和Cox2)兩個線粒體編碼的亞基中,并與CCO銅伴侶蛋白(Cox17、Cox11、Sco1和Sco2)協(xié)同轉運。缺乏Cox17的小鼠會導致CCO活性受損，胚胎在子宮內早期死亡，這證明線粒體中銅分子伴侶是必要的[16]。在細胞培養(yǎng)中，CCO與銅的亞基相結合，降低了Cox1和Cox2蛋白表達以及CCO活性，Cox17穩(wěn)定表達受阻[17]，CCO的銅伴侶蛋白Sco1和Sco2蛋白可以將Cox17和2個Cu原子轉運到Cox2的Cu A位點。降低CCO活性會引起新生兒肝功能衰竭和肥厚性心肌病，增加了新生兒的死亡率。與Atox1、Sco1、Sco2作用相一致，CCO已被證實不僅是銅關鍵的組合因子，而且對銅穩(wěn)態(tài)中細胞銅轉運有調節(jié)作用。而這些與線粒體相關蛋白顯然在CCO的合成中發(fā)揮重要作用，銅轉入特定亞基的過程目前還不清楚，銅是如何通過其他轉運體轉入線粒體的還有待研究。

2 銅的轉出及排泄與腎臟細胞內的銅穩(wěn)態(tài)

銅經(jīng)過腎臟腎小管和集合管的重吸收作用，吸收的Cu2+離子在胞內形成銅池，而銅的轉出、排泄途徑會限制胞內銅池的含量，并將過量的銅排泄到原尿中，將銅排出，確保腎臟細胞的銅穩(wěn)態(tài)平衡。哺乳動物的銅離子轉運ATP酶(ATP7A和ATP7B)，負責將銅轉運到分泌腔，并與銅依賴酶如銅藍蛋白，酪氨酸酶和其他酶結合。此外，ATP7A和ATP7B在特定的細胞和組織銅轉出的過程中起關鍵作用。這些銅泵主要是通過從胞漿銅伴侶Atox1接受銅，與ATP7A和ATP7B銅跨膜泵與其生理機制相似，它們在銅轉出過程中發(fā)揮了關鍵作用[18]。ATP7A基因突變導致門克斯(Menkes)病變，致使腸銅阻塞、外周銅缺乏而產(chǎn)生致命危險，此癥狀通常發(fā)生在2或3周齡。在生理上，Menkes病的表現(xiàn)是無法開啟腸上皮細胞基底膜的邊緣的銅泵，或者穿過血腦屏障，導致腸道銅的堆積、外周銅依賴酶供應減少。ATP7B基因突變導致威爾遜(Wilson)病，其原因是銅在肝臟和神經(jīng)組織中的過度積累。由于ATP7A和ATP7B功能是跨膜運輸銅，因此產(chǎn)生不同疾病時，會導致特定的細胞和組織發(fā)生病變。

在銅飽合的情況下，通過腎小球毛細血管濾過作用銅排出量相對較低。研究表明腎臟中銅缺乏癥是很難治愈的,腎臟與其他組織相比更能抵抗低銅狀態(tài)[19]。ATP7A和ATP7B共同定位于近端和遠端腎小管的細胞中，然而只有ATP7A已報道在高銅情況下在部分腎臟基底膜表達,研究發(fā)現(xiàn) ATP7B 在小鼠腎小球及腎髓質中表達[20]。隨著細胞中的銅離子濃度增加，血液會以儲存銅或肝臟排泄銅來保護腎細胞免受銅毒性[21]。敲除腎臟中CTR1或ATP7A/B的小鼠可以作為一種分析腎臟在銅系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮的作用的工具。對其研究，可發(fā)現(xiàn)在腎臟中銅轉運蛋白對銅的抑制作用。

3 其他類上皮細胞組織銅穩(wěn)態(tài)調節(jié)機制的啟發(fā)

比較不同上皮細胞的銅平衡規(guī)律可能有助于揭示腎臟細胞銅穩(wěn)態(tài)調控的新途徑。在胎盤和乳腺的上皮細胞銅轉運過程中，會發(fā)生類似腎小管上皮細胞一樣的跨越上皮細胞屏障現(xiàn)象。在胎盤和乳腺細胞可通過改變銅水平以及激素調節(jié)來調節(jié)ATP7A蛋白的表達[22-23]。在乳腺組織中，上皮細胞頂端質膜區(qū)的ATP7B轉運蛋白，在催乳激素誘導下，將銅跨越上皮組織屏障，排入到乳液中[24]。此外，現(xiàn)已證實位于基底外側膜的由催乳素誘導的APT7A和CTR1與乳液中銅增加有關。在胎盤組織中，通過胰島素和雌激素的調節(jié)下，ATP7A及ATP7B在特定位轉錄被激活，ATP7B攜銅位于上皮細胞的高爾基體，然而ATP7A則將銅轉出到基底側膜[25]。

以上的研究表明腎臟中銅吸收可能是通過不同器官間的激素調節(jié)及轉運蛋白相互作用的結果。與上述推測類似的是關于肝臟激素之一的鐵調素，參與腎臟鐵吸收的，一并起到關鍵作用。未來可對腎臟中相關激素或類激素的銅穩(wěn)態(tài)調控機制進一步研究。

4 結語

大量研究已經(jīng)明確了調節(jié)腎臟細胞銅穩(wěn)態(tài)的分子機制。腎臟銅穩(wěn)態(tài)是由多種銅轉運蛋白、含銅酶及細胞內外銅水平的動態(tài)調控的結果。目前，對于腎臟細胞的幾種主要的轉運蛋白的調節(jié)途徑已經(jīng)充分認識，但在銅伴侶蛋白的干涉、啟動子的誘導以及激素調節(jié)在腎臟細胞銅平衡調控上有待進一步深入研究。

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