荊 煒，單新新，程于夢，姚 紅，李德喜，杜向黨

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州 450046)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)是人獸共患的條件致病菌，可在醫(yī)學(xué)臨床中引起肺炎、腸炎、腦膜炎、眼內(nèi)炎、敗血癥、肝膿腫等嚴(yán)重感染性疾病[1]，位居革蘭陰性病原菌感染的第2位[2]。由于多種抗生素的不合理使用，甚至濫用，肺炎克雷伯菌發(fā)生嚴(yán)重耐藥危機(jī)，多重耐藥肺炎克雷伯菌(Multidrug-resistantK.pneumoniae，MRKP)在全球范圍內(nèi)迅速播散。MRKP不僅對(duì)氨基糖苷類、青霉素類、頭孢菌素類等高度耐藥[3]，還突破了碳青霉烯類抗菌藥的防線，成為“超級(jí)細(xì)菌”。21世紀(jì)，肺炎克雷伯菌與屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)及腸桿菌屬細(xì)菌(Enterobacterspecies)被美國傳染病學(xué)會(huì)評(píng)定為耐藥情況最嚴(yán)峻的6類細(xì)菌，取其各自拉丁文名首字母而簡稱ESKAPE[4]。

替加環(huán)素是第一個(gè)被批準(zhǔn)用于臨床治療的新型甘氨酰環(huán)素類抗生素，也是繼米諾環(huán)素后開發(fā)的新一代四環(huán)素類抗生素。它通過可逆結(jié)合細(xì)菌核糖體30S亞基，阻斷tRNA進(jìn)入核糖體A位點(diǎn)來抑制蛋白質(zhì)的合成，達(dá)到抗菌目的。替加環(huán)素與核糖體的親和力遠(yuǎn)高于四環(huán)素和米諾環(huán)素，因此具有更高的抗菌活性，可以治療大多數(shù)革蘭陰性菌、陽性菌和厭氧菌以及“非典型”細(xì)菌感染[5]，甚至成為治療產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌等感染的最后一道防線。然而，隨著替加環(huán)素在臨床抗肺炎克雷伯菌感染治療中的頻繁使用，替加環(huán)素敏感性下降的肺炎克雷伯菌菌株逐漸增多且存在多種耐藥機(jī)制。作為目前臨床抗感染治療中面臨的最嚴(yán)峻問題，肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素耐藥的相關(guān)機(jī)制研究備受國內(nèi)外關(guān)注?，F(xiàn)就肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以便為減少細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生，延長替加環(huán)素使用壽命提供理論依據(jù)。

1 主動(dòng)外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

肺炎克雷伯菌的耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣，其中主動(dòng)外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是形成肺炎克雷伯菌多重耐藥的主要原因之一。主動(dòng)外排泵廣泛存在于肺炎克雷伯菌的基因組中，能將菌體內(nèi)的藥物或作用底物，選擇性或非選擇性的泵出體外，導(dǎo)致體內(nèi)抗菌藥物濃度下降，表現(xiàn)耐藥[6-7]。Piddock L等[8]研究發(fā)現(xiàn)除細(xì)菌耐藥之外，主動(dòng)外排泵還參與細(xì)菌自身代謝產(chǎn)物和有害化合物的排泄，以及細(xì)菌早期感染過程中的定植等，表明主動(dòng)外排泵在細(xì)胞體內(nèi)具有非常重要的生理作用。一株細(xì)菌可同時(shí)含有多個(gè)主動(dòng)外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)且其轉(zhuǎn)運(yùn)底物具有非特異性，肺炎克雷伯菌通過這些外排系統(tǒng)把多種結(jié)構(gòu)各異的抗菌藥物排出體外，最終表現(xiàn)對(duì)多種抗菌藥物耐藥。目前已知參與肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素耐藥的外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有AcrAB-TolC外排泵、OqxAB外排泵、KpgABC外排泵和Tet(A)外排泵變異體，其中AcrAB-TolC外排泵、OqxAB外排泵和KpgABC外排泵均屬于耐藥結(jié)節(jié)細(xì)胞分化(resistance nodulation-cell division，RND)家族，Tet(A)外排泵變異體屬于主要易化子(the major facilitator，MFS)超家族。

1.1 AcrAB-TolC外排泵

AcrAB-TolC外排泵是典型的RND家族外排轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，在多重耐藥肺炎克雷伯菌的產(chǎn)生過程中起重要作用，由內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcrB、膜融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC三部分組成[9]。目前對(duì)替加環(huán)素耐藥的研究表明，AcrAB-TolC外排泵活性與細(xì)菌對(duì)替加環(huán)素是否敏感相關(guān)。內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcrB受阻遏基因(ramR,marR,socR)編碼的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(RamA，MarA，SoxS)調(diào)控，其上調(diào)會(huì)導(dǎo)致替加環(huán)素敏感性下降[10-11]。He F等[12]在3株產(chǎn)碳青霉烯酶(KPC)且對(duì)替加環(huán)素耐藥的肺炎克雷伯菌中檢測到RamA過表達(dá)，序列分析發(fā)現(xiàn)這3株肺炎克雷伯菌的ramR基因均在相同位點(diǎn)發(fā)生突變，功能性試驗(yàn)證實(shí)ramR基因突變使RamA的表達(dá)不受抑制，間接導(dǎo)致AcrB過表達(dá)，引起AcrAB-TolC上調(diào)，表現(xiàn)出對(duì)替加環(huán)素耐藥。隨后Wang X等[13]發(fā)現(xiàn)并非ramR基因突變引起的RamA表達(dá)上調(diào)都能導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素耐藥。在菌株KP51中，即使RamA發(fā)生近30倍的過表達(dá)，也未導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素耐藥，說明肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素耐藥性的產(chǎn)生受多種因素調(diào)控。Zhong X等[11]用外排泵抑制劑(EPI)CCCP對(duì)外排泵的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，調(diào)控因子MarA、SoxS和RamA均對(duì)AcrAB-TolC外排泵的過表達(dá)具有貢獻(xiàn)。其中RamA與MarA均可參與AcrB的過表達(dá)，表明RamA不是賦予肺炎克雷伯菌替加環(huán)素抗性的必要基因，MarA可作為替代調(diào)節(jié)因子，影響AcrB外排蛋白的活性，進(jìn)而導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素耐藥。同時(shí)Ye M等[14]從患有陰囊膿腫的病人體內(nèi)分離到2株對(duì)替加環(huán)素耐藥的肺炎克雷伯菌，對(duì)其ramR區(qū)域進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)它們的ramR開放閱讀框不存在突變，而ramR上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome binding site，RBS)區(qū)域發(fā)生一段12 bp的缺失。隨后證實(shí)ramR的RBS位點(diǎn)缺失影響轉(zhuǎn)錄之后的蛋白質(zhì)翻譯過程，間接導(dǎo)致AcrB的表達(dá)水平失控，引發(fā)肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素產(chǎn)生抗性。這項(xiàng)研究表明不僅阻遏基因(ramR,marR,socR)突變可引起AcrAB-TolC外排泵過表達(dá)，使肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素耐藥，序列缺失也可導(dǎo)致同樣的結(jié)果?？茖W(xué)監(jiān)測肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素的耐藥情況，從多角度進(jìn)行分子生物學(xué)水平研究，將有助于豐富對(duì)替加環(huán)素抗性機(jī)制的認(rèn)識(shí)。Roy S等[15]對(duì)引發(fā)新生兒血液感染的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌替加環(huán)素耐藥性進(jìn)行研究，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)RamA的表達(dá)增加與替加環(huán)素的MIC值增加呈正相關(guān)，AcrAB泵的過表達(dá)導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素的敏感性降低。

隨著研究的深入，Li F等[16]構(gòu)建了肺炎克雷伯菌中第1個(gè)lon基因突變體，并且證明Lon蛋白酶參與細(xì)菌中MarA的降解，其功能缺失會(huì)導(dǎo)致MarA表達(dá)量升高，進(jìn)而導(dǎo)致AcrAB-TolC外排泵的表達(dá)量上調(diào)，使肺炎克雷伯菌表現(xiàn)出更強(qiáng)的替加環(huán)素抗性。Li F在lon基因中檢測到3種不同類型的點(diǎn)突變，互補(bǔ)和基因敲除試驗(yàn)表明，lon突變體比野生型肺炎克雷伯菌顯示更強(qiáng)的替加環(huán)素抗性，而lon基因敲除株又比突變株顯示更強(qiáng)的替加環(huán)素抗性。相關(guān)研究還指出Lon蛋白酶的失活涉及大腸埃希菌和鼠傷寒沙門菌中替加環(huán)素的抗性，但需要進(jìn)一步研究和證實(shí)[17-18]。

以上研究都表明對(duì)調(diào)控AcrAB-TolC外排泵表達(dá)的因子進(jìn)行深入研究，在研發(fā)新藥和改良現(xiàn)存藥物方面具有重要意義，Rosenblum R等[19]分離到1株無ramA和AcrAB過表達(dá)卻對(duì)替加環(huán)素高度耐藥的臨床肺炎克雷伯菌，猜測肺炎克雷伯菌中存在對(duì)替加環(huán)素耐藥的其他途徑。因此，AcrAB-TolC外排泵不是導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素耐藥的唯一因素，肺炎克雷伯菌可通過其他未知途徑，引起替加環(huán)素耐藥。

1.2 OqxAB外排泵

OqxAB外排泵也屬于RND家族外排系統(tǒng)，由膜融合蛋白OqxA和內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OqxB組成，是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的由質(zhì)粒編碼并且可介導(dǎo)酰胺醇類、喹噁琳類、氟喹諾酮類等多種藥物耐藥的外排系統(tǒng)。目前關(guān)于OqxAB外排泵的流行病學(xué)和耐藥機(jī)制研究相對(duì)較少，僅證明oqxAB是OqxAB外排泵系統(tǒng)中起主要作用的保守基因，且攜帶oqxAB基因的質(zhì)粒容易在不同種屬的細(xì)菌間水平傳播。Lin Y T等[20]從肺炎克雷伯菌感染的病人體內(nèi)分離到1株高毒力菌株，該菌株最初是替加環(huán)素敏感型(TS)，然后變?yōu)樘婕迎h(huán)素非敏感型(TNS)，發(fā)現(xiàn)TNS菌株的rarA和OqxB表達(dá)水平提高，認(rèn)為rarA是肺炎克雷伯菌中OqxB表達(dá)的調(diào)控因子，且與替加環(huán)素抗性機(jī)制相關(guān)。隨后，Sheng Z K等[21]在對(duì)替加環(huán)素耐藥的肺炎克雷伯菌研究中證實(shí)rarA是OqxAB 外排泵的正轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，rarA的高表達(dá)可引起內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OqxB表達(dá)上調(diào)，最終導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素耐藥。Zhong X等[11]分離得到2株rarA基因表達(dá)水平較高但OqxAB外排泵正常的替加環(huán)素耐藥肺炎克雷伯菌，說明除rarA之外，還存在一些其他調(diào)節(jié)因子參與OqxAB的表達(dá)調(diào)控。此外，OqxAB外排泵介導(dǎo)肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素耐藥是否需要AcrAB外排泵參與，OqxAB外排泵是否與介導(dǎo)肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素高水平耐藥有關(guān)，OqxAB 外排泵中的膜融合蛋白OqxA是否對(duì)替加環(huán)素耐藥產(chǎn)生影響等問題還未解決[22]，需要進(jìn)一步探索。

1.3 KpgABC外排泵

KpgABC外排泵是一種新型的RND家族外排泵。Nielse L E等[23]在肺炎克雷伯菌的外排泵操縱子上游發(fā)現(xiàn)了1個(gè)IS5插入序列引起外排泵KpgABC表達(dá)上調(diào)，隨后將此外排系統(tǒng)導(dǎo)入至缺失kpgABC基因的菌株中，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，替加環(huán)素MIC值上升4倍。同時(shí)，通過克隆轉(zhuǎn)化試驗(yàn)證實(shí)，即使沒有AcrAB-TolC外排泵的參與，單獨(dú)的KpgABC外排系統(tǒng)即可導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素的耐藥水平大幅度升高。插入序列(insertion sequence)由一段編碼轉(zhuǎn)座酶的DNA序列組成，是一段最簡單的轉(zhuǎn)座子。它位于不同的質(zhì)?；蛭稽c(diǎn)上，攜帶1個(gè)保守的通用的三聯(lián)氨基酸DDE模體，作為轉(zhuǎn)座酶的活化位點(diǎn)，進(jìn)行轉(zhuǎn)座酶編碼，轉(zhuǎn)座自己或整個(gè)轉(zhuǎn)座子。IS5作為家族成員最多的插入序列對(duì)耐藥基因的轉(zhuǎn)移發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。上述研究闡明了肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素耐藥的新機(jī)制，完善了我們對(duì)替加環(huán)素耐藥機(jī)制的新認(rèn)識(shí)。

1.4 Tet(A)突變體

Tet(A)屬于主要易化子超家族(major facilitator super,MFS)外排泵，可引起細(xì)菌對(duì)四環(huán)素高度耐藥。Tuckman M等[24]發(fā)現(xiàn)tet(A)基因突變可降低大腸埃希菌對(duì)替加環(huán)素的敏感性；Akiyama T等[25]證明tet(A)基因突變可以降低沙門菌對(duì)替加環(huán)素的敏感性；Hentschke M等[26]報(bào)道了降低替加環(huán)素敏感性的tet(A)基因位于轉(zhuǎn)座子Tn1721中，且既能定位于質(zhì)粒，也可定位于染色體。我們在2017年分離到1株ST11型高毒力肺炎克雷伯菌，此菌株不僅包含碳青霉烯酶在內(nèi)的多種抗生素耐藥基因，還攜帶tet(A)變異體，功能性試驗(yàn)證實(shí)tet(A)變異體可介導(dǎo)肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素敏感性降低[27]。由于在不同國家的食物，臨床樣品，環(huán)境和人類微生物群落中均能檢測到tet(A)基因，越來越多的研究證明含有突變的Tet(A)在四環(huán)素抗性細(xì)菌中更占優(yōu)勢，tet(A)基因突變作為一個(gè)新機(jī)制，將促進(jìn)替加環(huán)素耐藥性的發(fā)展。

2 核糖體蛋白

核糖體蛋白S10由rpsJ基因編碼，是核糖體30S亞基的1個(gè)組成部分，位于四環(huán)素和替加環(huán)素在核糖體30S的主要結(jié)合位點(diǎn)附近。Villa L等[28]得到3株對(duì)替加環(huán)素耐藥的肺炎克雷伯菌，其中2株具有RamR突變，這與已經(jīng)證實(shí)的AcrAB-TolC外排系統(tǒng)過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肺炎克雷伯菌產(chǎn)生替加環(huán)素抗性結(jié)論一致；而第3株則顯示位于核糖體30S亞基中與替加環(huán)素作用靶點(diǎn)相鄰的S10核糖體蛋白的編碼基因rpsJ發(fā)生了點(diǎn)突變，聯(lián)想以往研究證實(shí)此突變介導(dǎo)淋病奈瑟氏球菌對(duì)四環(huán)素高水平耐藥，Villa L等對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)rpsJ突變或改變替加環(huán)素結(jié)合位點(diǎn)附近的核糖體結(jié)構(gòu)，或擾亂Mg2+離子配位，導(dǎo)致替加環(huán)素與16S rRNA的結(jié)合減弱，敏感性下降。這是首次提出rpsJ突變與肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素耐藥相關(guān)。Beabout K等證實(shí)單獨(dú)rpsJ突變能夠賦予糞腸球菌替加環(huán)素抗性后，對(duì)6種臨床常見病原菌進(jìn)行適應(yīng)性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和屎腸球菌均能通過突變r(jià)psJ保守區(qū)位點(diǎn)降低替加環(huán)素敏感性[29]。因此，核糖體蛋白S10的結(jié)構(gòu)改變也是一種潛在的新機(jī)制，值得在后續(xù)的研究中予以關(guān)注。Lupien A等[30]的研究表明，除了S10之外，核糖體蛋白S3、S13也位于四環(huán)素與核糖體亞基的結(jié)合域附近，且S3已被證實(shí)具有維持四環(huán)素結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)完整的功能，同理推斷S3蛋白的結(jié)構(gòu)突變也可能會(huì)引起替加環(huán)素耐藥。隨著替加環(huán)素抗性與rpsJ突變有關(guān)的報(bào)道越來越多，有研究證實(shí)，在沒有外排泵參與的情況下，rpsJ基因突變可導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)替加環(huán)素特異性耐藥，是引起替加環(huán)素耐藥的第二大原因。

3 展望

近年來，高致病性和多重耐藥肺炎克雷伯菌的檢出率越來越高，碳青霉烯類藥物防線失守使臨床抗感染治療幾乎陷入無藥可醫(yī)的地步，如何減少替加環(huán)素耐藥肺炎克雷伯菌的出現(xiàn)，延長替加環(huán)素的使用壽命成為一個(gè)全世界關(guān)注的熱點(diǎn)問題。現(xiàn)有的研究表明，主動(dòng)外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，尤其AcrAB-TolC外排泵上調(diào)引起的耐藥是主要的耐藥機(jī)制；rpsJ基因缺失突變可不依賴菌種而導(dǎo)致替加環(huán)素耐藥，成為新的替加環(huán)素抗性機(jī)制。

上述耐藥機(jī)制的深入研究，可為改進(jìn)現(xiàn)有抗生素，開發(fā)新型抗菌藥物提供新思路。鑒于替加環(huán)素在治療多重耐藥菌株肺炎克雷伯菌的重要性，迫切需要加強(qiáng)對(duì)替加環(huán)素耐藥肺炎克雷伯菌的監(jiān)測。

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