陳 靖，田 源，白國輝,2*

(1.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物研究中心,貴州遵義 563000; 2.貴州省高等學(xué)?？谇患膊√厣攸c實驗室,貴州遵義 563000; 3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，貴州遵義 563000)

DNA感受器位于細胞漿內(nèi)，類似于模式識別受體，能快速識別病原體迅速激活固有、適應(yīng)性免疫應(yīng)答。已有研究表明一些DNA感受器可以作為基因疫苗佐劑應(yīng)用。DNA代謝的副產(chǎn)物類似于病原相關(guān)分子模式，來自死亡細胞的遺傳物質(zhì)可以作為佐劑改善基于蛋白質(zhì)的疫苗的免疫原性。近年來發(fā)現(xiàn)DNA質(zhì)粒及其代謝產(chǎn)物可作為抗原直接與DNA感受器相互作用，進入細胞胞質(zhì)的DNA(被機體認為是一種病原體感染的危險信號)可以被DNA感受器識別、結(jié)合，快速激活固有免疫應(yīng)答在成纖維細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的Ⅰ型干擾素(IFN)，增強DNA疫苗的免疫效應(yīng)[1]。本文對國內(nèi)外關(guān)于DNA感受器(DDX41，cGAS，ZBP1/DAI，RIG-I，MDA5，HMGB，IRF-1)、DNA質(zhì)粒的代謝產(chǎn)物及其類似物(c-diGMP，DMXAA，CMA)作為佐劑的最新研究進展做一綜述。

1 DNA感受器作為佐劑

1.1 DDX41

DDX41是解旋酶DEXDc家族的成員。作為細胞質(zhì)DNA傳感器，識別細胞質(zhì)DNA、病毒DNA、細菌第二信使c-di-GMP通過DEAD結(jié)構(gòu)域與STING結(jié)合通過激活STING-TBK1-IRF3信號通路誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素[2]。DDX41能通過與CDN(cyclic dinucleotides)的結(jié)合誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生[3]。Lazarte J M等[4]將DDX41作為佐劑構(gòu)建疫苗(pEF-GD)免疫橄欖比目魚，發(fā)現(xiàn)通過加入分子佐劑DDX41，誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素增強了適應(yīng)性免疫應(yīng)答，提高了比目魚的存活率。

1.2 cGAS

cGAS(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase)是通過產(chǎn)生第二信使cGAMP(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate)誘導(dǎo)干擾素的細胞溶質(zhì)DNA傳感器[5]。哺乳動物細胞中的cGAS被入侵宿主細胞的細菌性或病毒性DNA激活，通過將DNA中GMP、AMP催化形成cGAMP激活STING相關(guān)的下游免疫信號通路，產(chǎn)生干擾素以及其他細胞因子[6]。研究顯示，來自cGAS缺陷型小鼠的細胞(包括成纖維細胞，巨噬細胞和樹突狀細胞)在DNA轉(zhuǎn)染或DNA病毒感染時不能產(chǎn)生Ⅰ型干擾素和其他細胞因子，表明cGAS是胞質(zhì)DNA傳感器[7]；cGAS是一種潛在佐劑，可通過誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素激發(fā)先天性免疫反應(yīng)[8-9]。

1.3 ZBP1/DAI

Z-DNA結(jié)合蛋白1(ZBP1)也被稱為干擾素調(diào)節(jié)因子激活物(DAI)或DLM-1，其直接結(jié)合dsDNA并增強其與IRF3和TBK1的結(jié)合，DAI(DLM-1/ZBP1)在小鼠成纖維細胞中的表達選擇性增強了DNA介導(dǎo)的Ⅰ型IFN和其他參與先天免疫因子的產(chǎn)生[10]。采用電穿孔法將攜帶腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigens，TAAs)DNA聯(lián)合DAI基因(作為佐劑)的質(zhì)粒接種于小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)促進有效的抗腫瘤細胞毒性T淋巴細胞產(chǎn)生，因此，顯示ZBP1/DAI在DNA疫苗具有佐劑的性質(zhì)[11]。

1.4 RIG-Ⅰ

視黃酸誘導(dǎo)型基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)poly(dA-dT)通過RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)變?yōu)镽NA(即5′-三磷酸RNA)，誘導(dǎo)Ⅰ型IFN產(chǎn)生[12]。雖然RIG-Ⅰ是細胞溶質(zhì)RNA受體，但RIG-Ⅰ敲低與dsDNA誘導(dǎo)的Ⅰ型IFN減少相關(guān)，因此，是感染病毒核酸誘導(dǎo)Ⅰ型IFN的先天免疫激活的細胞溶質(zhì)DNA感受器[13-14]。構(gòu)建以RIG-Ⅰ為佐劑的DNA疫苗，結(jié)果顯示疫苗效誘導(dǎo)Ⅰ型IFN產(chǎn)生并提高流感特異性血清抗體水平[15]。即使在低抗原劑量下，RIG-Ⅰ通過STING途徑的激活也可以誘導(dǎo)增強適應(yīng)性免疫應(yīng)答，這表明RIG-Ⅰ可作為有效的DNA疫苗佐劑。

1.5 MDA5

RIG-Ⅰ樣受體家族的重要成員MDA5(黑素瘤差異化相關(guān)基因5)，較 RIG-Ⅰ具有更強誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型IFN反應(yīng)的能力[16]。將chMDA5的N-末端片段[chMDA5(1-483)]結(jié)合H5N1的血凝素(HA)形成共表達質(zhì)粒免疫雞群,結(jié)果顯示與單獨的HA DNA接種相比，chMDA5(1-483)輔助的HA DNA疫苗誘導(dǎo)更強的免疫反應(yīng)，MDA5可作為有效的DNA疫苗佐劑加以應(yīng)用[17]。

1.6 HMGB1

高遷移率組蛋白B1(HMGB1)位于細胞核中，它不僅直接與DNA結(jié)合且招募其他蛋白質(zhì)形成DNA-HMGB1復(fù)合物，可作為DNA調(diào)節(jié)器,HMGB1可以識別并結(jié)合外源性核酸，誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型IFN，激發(fā)固有免疫反應(yīng)[18]。

將HPV16 E7作為抗原和HMGB1作為佐劑構(gòu)建DNA疫苗免疫小鼠，HMGB1以及其衍生短肽HP91可作為HPV疫苗的佐劑，用于改善HPV DNA疫苗的免疫原性[19]。

1.7 IRF-1

IRF-1是誘導(dǎo)干擾素表達蛋白中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族中的一個成員，其與IFN及IFN誘導(dǎo)性基因中的順式作用元件結(jié)合，調(diào)控Ⅰ型IFN及相關(guān)基因的表達[20]。將IRF家族(IRF-1，IRF-3和IRF-7)的轉(zhuǎn)錄因子作為HIV-1 DNA疫苗的佐劑免疫Balb/c小鼠，發(fā)現(xiàn)只有IRF-1增強了抗原特異性免疫應(yīng)答，因此IRF-1可作為DNA疫苗接種的佐劑[21]。DNA感受器作為識別受體與結(jié)合外來抗原,通過共同的STING-IRF3-IFN信號通路誘導(dǎo)IFN干擾素的產(chǎn)生而到達類似免疫佐劑增強免疫反應(yīng)的作用。

2 DNA質(zhì)粒代謝物作為佐劑

2.1 c-diGMP

環(huán)狀二-GMP(c-diGMP)是由細菌合成的小核苷酸第二信使。環(huán)二核苷酸 c-di-GMP、c-di-AMP 可以通過直接與STING(作為DNA感受器)的作用誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素,當c-diGMP轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞時,利用與dsDNA相同的信號途徑通過直接結(jié)合STING并激活下游TBK1-IRF3信號,誘導(dǎo)高水平的Ⅰ型IFN[22]。向Balb/c小鼠鼻內(nèi)接種NIBRG-14(H5N1)血凝素(HA)和c-di-GMP(作為佐劑)構(gòu)建的疫苗，發(fā)現(xiàn)c-di-GMP誘導(dǎo)更多病毒特異性CD4+T細胞產(chǎn)生，增強了疫苗的免疫效果[23]。表明c-di-GMP作為佐劑可以誘導(dǎo)Th1細胞反應(yīng)增強，細胞因子升高。

構(gòu)建疫苗通過激活c-di-GMP可抑制小鼠B16黑素瘤的免疫原性提高抗腫瘤作用，說明c-di-GMP是有效的疫苗佐劑[24]。

2.2 DMXAA

DMXAA，即5,6-二甲基呫噸酮-4-乙酸，是一種合成小分子化合物，是一種強有力的Ⅰ型IFN誘導(dǎo)劑。DMXAA參與TBK1-IRF3信號通路誘導(dǎo)Ⅰ型IFN產(chǎn)生。將其作為佐劑與OVA(作為抗原)免疫小鼠，證明與單獨OVA疫苗相比，其通過TBK1-IRF3信號軸產(chǎn)生Ⅰ型IFN，誘導(dǎo)更強且持久的特異性免疫反應(yīng)。

2.3 CMA

抗病毒化合物10-羧甲基-9-吖啶酮(CMA)是一種有效的通過STING-TBK1-IRF3通路的Ⅰ型IFN誘導(dǎo)劑。

3 結(jié)語

國內(nèi)外研究者多次利用DNA疫苗進行了針對感染性疾病(如流感、乙型肝炎、艾滋病和瘧疾等)和非感染性疾病(如非病毒性癌癥等)的人類臨床試驗，但比在其他哺乳動物中觀察到的免疫原性更低。為改善DNA疫苗的免疫原性進行的研究已經(jīng)表明，理解DNA疫苗的作用機制可能是成功改善其免疫原性的關(guān)鍵。研究者們目前的理解是DNA疫苗以兩種方式誘導(dǎo)先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，第一種方式是通過DNA質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)(或多肽)抗原可以在基質(zhì)細胞(即，肌肉細胞)以及DC中表達，這些抗原被加工通過直接或交叉呈遞給幼稚的CD4或CD8T細胞。第二種方式是轉(zhuǎn)染的DNA質(zhì)粒及其代謝物(例如cGAS，c-diGMP)與DNA感受器相互作用并激活STING-TBK1-IRF3途徑產(chǎn)生Ⅰ型IFN、前炎性細胞因子等激活并啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答[25]。

傳統(tǒng)的佐劑可能產(chǎn)生某些不良反應(yīng)。理想的佐劑應(yīng)該不僅具有增強免疫應(yīng)答的作用，而且生物安全性較好。理想的佐劑應(yīng)該不僅可以誘導(dǎo)較強和持久的免疫應(yīng)答，而且要盡量減少其對機體的不良反應(yīng)。新型DNA感受器佐劑不僅可以通過快速激發(fā)固有免疫以刺激更強的適應(yīng)性免疫應(yīng)答提高了免疫反應(yīng)的強度，而且DNA質(zhì)粒的代謝產(chǎn)物及DNA感受器作為信號分子佐劑安全性較好，符合新型佐劑對生物安全性要求高的標準。

深入研究DNA感受器分子特征、免疫功能及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，其與DNA質(zhì)粒的相互作用的機制對于揭示DNA疫苗的免疫機制、提高疫苗的效應(yīng)和研發(fā)分子佐劑具有重要意義。截至目前，除文中討論的信號分子作為基因佐劑外,對于已證明是DNA傳感器的黑色素瘤缺乏因子2(AIM2),γ干擾素誘導(dǎo)蛋白16(也稱為p204),STING(最有潛力的DNA感受器,幾乎參與所有胞內(nèi)B型dsDNA模式識別受體介導(dǎo)的IFN-β通路)。作為佐劑性質(zhì)的研究尚未見國內(nèi)外的相關(guān)報道。DNA感受器及其代謝產(chǎn)物作為佐劑的研究為理想佐劑的研制開拓出一條新的思路，為DNA疫苗的分子設(shè)計提供新的思路和應(yīng)用前景。

參考文獻：

[1] Lee K G,Kim S S,Kui L,et al.Bruton's tyrosine kinase phosphorylates DDX41 and activates its binding of dsDNA and STING to initiate type 1 interferon response[J].Cell Rep,2015,10(7):1055-1065.

[2] Jiang Y,Zhu Y P,Liu Z J,et al.The emerging roles of the DDX41 protein in immunity and diseases[J].Protein Cell,2017,8(2):83-89.

[3] Zhang Z Q,Yuan B,Bao M S.et al.The helicase DDX41 senses intracellular DNA mediated by the adaptor STING in dendritic cells[J].Nat Immunol,2011,12(10):959-965.

[4] Lazarte J M,Kim Y R,Lee J S,et al.Enhancement of glycoprotein-based DNA vaccine for viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) via addition of the molecular adjuvant,DDX41.[J].Fish Shellfish Immunol,2017,62(23):356-365.

[5] Sun L J,Wu J X ,Du F H,et al.Cyclic GMP-AMP synthase is a cytosolic DNA sensor that activates the type I interferon pathway.[J].Science,2012,339(6121):786-791.

[6] Angela C,Hao C.Cyclic GMP-AMP synthase is an innate immune DNA sensor forMycobacteriumtuberculosis[J].Cell Host Microbe,2015,17(6):820-828.

[7] Li X D,Chen Z J.Pivotal roles of cGAS-cGAMP signaling in antiviral defense and immune adjuvant effects.[J].Science,2013,341(6152):1390.

[8] Heidegger S,Haas T,Poeck H.Cutting edge in IFN regulation:inflammatory caspases cleave cGAS[J].Immunity,2017,46(3):333-335.

[9] Watson R O,Bell S L,Macduff D A,et al.The cytosolic sensor cGAS detectsMycobacteriumtuberculosisDNA to induce type I interferons and activate autophagy[J].Cell Host Microbe,2015,17(6):811.

[10] Pearson J S,Giogha C,Mühlen S,et al.Erratum:EspL is a bacterial cysteine protease effector that cleaves RHIM proteins to block necroptosis and inflammation.[J].Nat Microbiol,2017,17(24):2058-5276.

[11] Lladser A,Mougiakakos D,Tufvesson H,et al.DAI( DLM-1 /ZBP1 ) as a genetic for DNA vaccines that promotes effective antitumor CTL immunity[J].Mol Ther,2011,19(30):594-601.

[12] Fitzgerald M E,Rawling D C,Potapova O,et al.Selective RNA targeting and regulated signaling by RIG-I is controlled by coordination of RNA and ATP binding[J].Nucleic Acids Res,2017:45(3):1442-1454.

[13] Chattopadhyay S,Sen G C.RIG-I-like receptor-induced IRF3 mediated pathway of apoptosis (RIPA):a new antiviral pathway[J].Protein Cell,2017,8(3):1-4.

[14] Brunen D,Mesman A W,Geijtenbeek T B.RIG-I-like receptors and intracellular Toll-like receptors in antiviral immunity[J].Future Virol,2017,8(2):183-194.

[15] Luke J M,Simon G G,S?derholm J,et al.Coexpressed RIG-I agonist enhances humoral immune response to influenza virus DNA vaccine[J].J Virol,2011,85(3):1370-1383.

[16] Wan Q,Yang C,Rao Y,et al.MDA5 induces a stronger interferon response than RIG-I to GCRV infection through a mechanism involving the phosphorylation and dimerization of IRF3 and IRF7 in CIK cells[J].Front Immunol,2017,8(189).

[17] Liniger M,Summerfield A,Ruggli N.MDA5 can be exploited as efficacious genetic adjuvant for DNA vaccination against lethal H5N1 influenza virus infection in chickens[J].PLoS One,2012,7(12)：e49952.

[18] Talebi S,Bolhassani A,Azad T M,et al.Immuno-stimulating peptide derived from HMGB1 is more effective than the N-terminal domain of Gp96 as an endogenous adjuvant for improvement of protein vaccines[J].Protein Peptide Let,2016,24(3):190-196.

[19] Talebi S,Bolhassani A,Sadat S M,et al.Hp91 immunoadjuvant:An HMGB1-derived peptide for development of therapeutic HPV vaccines[J].Biomed Pharmacother,2017,85:148-154.

[20] Castaldello A,Sgarbanti M,Marsili G,et al.Interferon regulatory factor-1 acts as a powerful adjuvant in tat DNA based vaccination[J].J Cell Physiol,2010,224(3):702-709.

[21] Tallam A,Perumal T M,Antony P M,et al.Gene regulatory network inference of immunoresponsive gene 1 (IRG1) identifies interferon regulatory factor 1 (IRF1) as its transcriptional regulator in mammalian macrophages[J].PLoS One,2016,11(2):e0149050.

[22] Ruangkiattikul N,Nerlich A,Abdissa K,cGAS-STING-TBK1-IRF3/7 induced interferon-β contributes to the clearing of non tuberculous mycobacterial infection in mice[J].Virulence,2017:1-13.

[23] Svindland S C,Pedersen G K,Pathirana R D,et al.A study of Chitosan and c-di-GMP as mucosal adjuvants for intranasal influenza H5N1 vaccine[J].Influ Other Respi Viruses,2012,7(6):1181-1193.

[24] Wang Z,Celis E.STING activator c-di-GMP enhances the anti-tumor effects of peptide vaccines in melanoma-bearing mice.[J].Cancer Immunol Immunother,2015,64(8):1057-1066.

[25] Ortegavillaizan M,Chico V,Martinezlopez A,et al.Development of new therapeutical/adjuvant molecules by pepscan mapping of autophagy and IFN inducing determinants of rhabdoviral G proteins[J].Mol Immunol,2016,70:118-124.