田亞凱

(河南農(nóng)業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院,河南 鄭州 450046)

犬源大腸桿菌可以引起犬急性腸道炎,這是一種以發(fā)生敗血癥、腹瀉為臨床特征的急性傳染病[1]。隨著抗菌藥物在犬上的廣泛應用,以及抗菌藥物的不合理使用、細菌耐藥性的水平轉移和垂直傳播,犬大腸桿菌的多重耐藥和交叉耐藥現(xiàn)象也越來越普遍,造成了抗菌藥物效果的不理想。喹諾酮類藥物屬于化學合成廣譜抗菌藥物,其作用機制主要是通過抑制細菌DNA的復制來殺滅細菌[2]。從第1種喹諾酮類藥物——萘啶酸(nalidixic acid)[3]被發(fā)現(xiàn)至今,已經(jīng)有4代喹諾酮類藥物在臨床上得到了應用。近年來,喹諾酮類藥物在獸醫(yī)臨床上的使用非常普遍,細菌對喹諾酮類藥物的耐藥率也越來越高。1998年,qnr基因在肺炎克雷伯菌的質粒上被首次發(fā)現(xiàn),這是第一個被發(fā)現(xiàn)由質粒介導的喹諾酮耐藥基因(Plasmid-Mediated Quinolone Resistance Genes, PMQR),它可以降低受體菌對氟喹諾酮類藥物的敏感性。由于新的變體被發(fā)現(xiàn),qnr被重新命名為qnrA[4]。隨后qnrB、qnrS、qnrC和qnrD一系列由質粒介導的喹諾酮耐藥性基因被相繼發(fā)現(xiàn)。qnr系列基因發(fā)揮耐藥作用的機制是：通過表達Qnr蛋白,這些蛋白與藥物的靶點結合,從而防止喹諾酮藥物破壞細菌的DNA解旋酶。而oqxA和oqxB基因是通過介導細菌的外排作用而發(fā)揮耐藥性[5]。

目前,國內(nèi)外關于食品動物源大腸桿菌對喹諾酮類藥物耐藥性的研究較多[6-7],但犬源大腸桿菌對質粒介導的喹諾酮耐藥基因oqxA、oqxB、qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS的研究卻很少有報道,因此本試驗對犬源大腸桿菌進行了PMQR基因檢測及藥物敏感性分析,旨在為臨床治療犬大腸桿菌感染提供重要依據(jù)和參考,也為深入研究喹諾酮耐藥基因的傳播提供基礎資料。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1菌株102株犬源大腸桿菌于2012～2014年分離自河南寵物交易市場和河南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)院。采用直腸拭子的方法采集樣品,然后無菌接種于LB肉湯,在麥康凱培養(yǎng)基上純化培養(yǎng),培養(yǎng)之后進行革蘭氏染色和鏡檢。疑似株經(jīng)VITEK-32全自動細菌鑒定系統(tǒng)鑒定，確認為大腸桿菌。大腸埃希菌ATCC25922和PCR陽性對照菌株皆由河南農(nóng)業(yè)大學吳華博士提供。

1.1.2試驗藥品所用6種抗菌藥物均為國產(chǎn)原料藥,其中：喹乙醇(OLA),含量≥96%;痢菌凈(MEQ),含量≥96%；氟苯尼考(FFC),含量≥98%;鹽酸環(huán)丙沙星(CIP),含量≥96%;氧氟沙星(OFL),含量≥95%;恩諾沙星(ENR),含量≥98%。用電子天平精密稱取各適量藥物,其中OLA用無菌去離子水配制成終濃度為2560 μg/mL的原液,MEQ、FFC、CIP、OFL、ENR用無菌去離子水配制成終濃度為5120 μg/mL的母液；將配制好的原液或母液用水系針式過濾器過濾除菌,置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?各貯存原液或母液在7 d內(nèi)用完。氟苯尼考用40%二甲基甲酰胺和60%乙醇助溶。

1.1.3試劑和儀器設備LB肉湯、MHB營養(yǎng)肉湯、麥康凱瓊脂均購自北京陸橋科技有限公司；2×TaqMaster Mix酶和DM2000 Maker均購自北京康為世紀生物有限公司;瓊脂糖購自上海生工生物工程有限公司; VITEK-32型全自動微生物鑒定系統(tǒng)購自梅里埃公司; DYY-8C型電泳儀購自北京市六一儀器廠; PCR儀購自杭州晶格科技有限公司;凝膠成像分析系統(tǒng)購自DINCO公司。

1.2　方法

1.2.1PCR模板的制備 挑純培養(yǎng)菌落,置入5 mL玻璃試管內(nèi),95 ℃水浴10 min,離心(17000×g)30 s。上清液即為基因檢測的模板液,然后置于冰箱-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物的設計和PCR擴增參照表1中參考文獻[8-14]中的引物序列,由上海生工生物工程有限公司合成qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、oqxA、oqxB、qepA基因的通用引物(見表1)。PCR體系為25 μL: Mix酶12.5 μL,上、下游引物各0.5 μL, DNA模板1.0 μL, ddH2O 10.7 μL。反應條件:94 ℃變性50 s,根據(jù)不同引物條件選擇不同的退火溫度,退火45 s,72 ℃延伸60 s,32個循環(huán);72 ℃延伸10 min。對PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳跑膠,然后用瓊脂糖凝膠電泳進行成像系統(tǒng)攝像。產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進行測序,進行Blast比對,確定陽性。

1.2.3藥物MIC值的測定6種試驗藥物經(jīng)微量肉湯法測定,耐藥標準參考CLSI標準，采用美國實驗室臨床和實驗室標準協(xié)會批準的MIC值測定方法進行測定。使用質控菌株ATCC 25922進行全程質控,并設陰、陽性對照,做兩次平行試驗。

表1　PCR所用引物序列

2　結果與分析

2.1　藥敏試驗結果

6種藥物對102株犬源大腸桿菌的敏感率、中介率、耐藥率見表2。結果(表2)表明：犬源大腸桿菌對3種喹諾酮類藥物和氟苯尼考的耐藥性都比較嚴重,尤其是對恩諾沙星的耐藥率達到了71.57%,對環(huán)丙沙星和氧氟沙星的耐藥率也分別達到了64.71%和48.04%,對氟苯尼考的耐藥率達到了58.82%;而喹乙醇和痢菌凈的抗菌效果比較好,犬源大腸桿菌對這2種藥物的耐藥率分別只有14.71%和0%。

表2　6種抗菌藥物對102株犬源大腸桿菌的藥敏試驗結果

2.2　PMQR基因的檢測情況

PCR檢測結果表明：在102株犬源大腸桿菌中,qnrS基因檢測結果為陽性的有15株,檢出陽性率為14.70%;oqxA基因檢測結果為陽性的有10株,檢出率為9.80%;oqxB基因檢測結果為陽性的有12株,檢出率為11.76%;其余基因未被檢測出。其中含有兩種耐藥基因的有9株,檢出率為8.82%;含有3種耐藥基因的有5株,檢出率為4.90%(見表3)。PCR檢測結果見圖1。

3　討論

喹諾酮類抗生素在人醫(yī)臨床和獸醫(yī)臨床上曾以抗菌活性強、抗菌譜廣以及很少產(chǎn)生交叉耐藥性和毒副作用小等特點得到廣泛應用。然而隨著喹諾酮類藥物在臨床上的普遍使用,由細菌耐藥性引起的抗菌藥物治療效果下降的問題也引起了人們的重視,越來越多的專家學者投入到細菌耐藥性的研究中。本次藥物敏感性試驗發(fā)現(xiàn),犬源大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性已經(jīng)很高,其中對恩諾沙星的耐藥率達到了70%,對氧氟沙星的耐藥率也達到了48%；而且犬源大腸桿菌的多重耐藥現(xiàn)象也非常嚴重,在102株犬源大腸桿菌中,有71株對兩種或兩種以上的藥物耐藥,占69.6%。日益嚴重的多重耐藥現(xiàn)象對犬細菌病的治療帶來了極大的威脅,需要通過規(guī)范、合理使用藥物來控制細菌耐藥性的上升。

表3　PMQR基因在犬源大腸桿菌中的分布

P：陽性對照； S：樣品； N：陰性對照。圖1　　qnrS、oqxA、oqxB基因的檢測結果

PMQR基因是質粒介導的耐藥基因,可以造成耐藥基因在細菌間的水平傳播,會加快喹諾酮類藥物耐藥性在細菌間的傳播,造成喹諾酮類藥物在臨床上抗菌效果的降低。本試驗對102株犬源大腸桿菌的PMQR基因進行了檢測,結果只有qnrS、oqxA、oqxB這3種基因被檢測出。含有qnrS基因的菌株在一定程度上具有對萘啶酸和氟喹諾酮類藥物的耐藥性[15];含有oqxAB基因的菌株可以通過該基因外排泵的作用增強對氯霉素類抗菌藥物、喹諾酮類抗菌藥物、消毒劑和甲氧芐啶等的耐藥性[13]。本試驗qnrS、oqxA、oqxB基因的檢出率低于國內(nèi)報道的食品動物源大腸桿菌的檢出率[16-18]，這可能與喹諾酮類藥物在食品動物上應用更普遍、更頻繁有關。在單一耐氟苯尼考的菌株中也發(fā)現(xiàn)了oqxA和oqxB耐藥基因,這可能導致犬源大腸桿菌通過oqxA和oqxB基因的外排作用對氯霉素類藥物產(chǎn)生耐藥性。犬源大腸桿菌耐藥基因與耐藥表型的符合率要低于食品動物上大腸桿菌耐藥基因型與耐藥表型的符合率,原因可能是犬源大腸桿菌耐藥基因的檢出率顯著低于食品動物源大腸桿菌,但犬源大腸桿菌對藥物的耐藥率并沒有明顯低于食品動物源大腸桿菌的耐藥率。

本試驗中雖然PMQR耐藥基因的檢出率較低,但是犬源大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥率很高，原因可能是PMQR基因本身只能介導低水平的對喹諾酮類藥物的耐藥性,但是PMQR基因的流行可以促進編碼DNA促旋酶的gyrA和gyrB基因的突變和編碼拓撲異構酶 IV的parC和parE基因的突變，從而引起高水平的耐藥[19-20]。喹乙醇和痢菌凈在犬細菌病上較少使用,但本試驗發(fā)現(xiàn)有一定的檢出率,表明oqxAB基因可能在不同來源菌株中水平傳播,從而造成oqxAB基因在犬源大腸桿菌中的流行,提示應加強抗菌藥物的合理使用和監(jiān)管,以減少耐藥性的傳播和擴散。

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