鄭培君，程海濤，齊明

(1.佛山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 佛山　528137；2.廣豐區(qū)農(nóng)業(yè)局，江西 上饒　334600)

廣式臘腸是嶺南地區(qū)傳統(tǒng)風(fēng)味特色食品，因其咸中帶甜、酒香醇厚的獨(dú)特風(fēng)味深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。龍卓珊等利用固相微萃取結(jié)合嗅覺(jué)檢測(cè)法鑒定出13種廣式臘腸特征風(fēng)味化合物，包括4種醛、8種酯和1種酮[1]。Du M和Ahn D U利用頂空氣質(zhì)聯(lián)用方法測(cè)定其風(fēng)味物質(zhì)成分主要有醇類(lèi)、酯類(lèi)、醛類(lèi)和酮類(lèi)物質(zhì)，還有部分烴類(lèi)和環(huán)類(lèi)化合物[2]。這些風(fēng)味物質(zhì)主要來(lái)源于輔料、非微生物直接參與的生化反應(yīng)(包括糖降解、蛋白質(zhì)水解、脂肪氧化、 Strecker降解、Maillard反應(yīng)等)以及微生物酶降解脂類(lèi)、蛋白質(zhì)和碳水化合物形成的風(fēng)味物質(zhì)。其中微生物對(duì)風(fēng)味物質(zhì)成分形成的重要作用早就被人們意識(shí)到，直達(dá)近十多年來(lái)，關(guān)于發(fā)酵劑對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味物質(zhì)成分的影響才有更深入的研究[3-5]。Berdagué在1993年首先提出，葡萄球菌對(duì)于干香腸芳香氣味的形成具有優(yōu)勢(shì)作用[6]。微球菌和葡萄球菌在發(fā)酵和成熟過(guò)程中能夠產(chǎn)生降解蛋白質(zhì)和脂肪的酶，酶解的產(chǎn)物在干發(fā)酵香腸特征風(fēng)味形成中起了重要作用[7]。Montel等研究也發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌屬的微生物和肉中自身脂酶共同作用，參與了脂肪的降解過(guò)程，對(duì)香腸中脂肪酸的釋放產(chǎn)生了一定的影響，大量的脂肪酸釋放出來(lái)，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化形成了甲基酮和醛，為肉制品提供了獨(dú)特的風(fēng)味[8]。本研究將分離自臘腸中的葡萄球菌和微球菌用于廣式臘腸的發(fā)酵生產(chǎn)，接種量為106cfu/g，采用固相微萃取與氣質(zhì)聯(lián)用的方法對(duì)臘腸中的風(fēng)味物質(zhì)成分進(jìn)行測(cè)定，分析接種分離菌株對(duì)廣式臘腸風(fēng)味的影響。

1　材料

1.1　菌種

使用菌株均由本研究室分離并保藏，葡萄球菌編號(hào)為H33B，微球菌編號(hào)為X142B。

1.2　材料與試劑

豬后臀肉、豬背膘、白砂糖、鹽、白酒、雞精、味精，均購(gòu)于當(dāng)?shù)爻?；試?yàn)中所用試劑，均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3　儀器與設(shè)備

SZ-22A型絞肉機(jī)、ZX-5L型手搖灌腸機(jī)廣州旭眾食品機(jī)械有限公司；101-3A型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱上海雷韻試驗(yàn)儀器制造有限公司； ZHJH-1112超凈工作臺(tái)、SPX-450生化培養(yǎng)箱上海新苗醫(yī)療器械制造公司；YX-280高壓滅菌鍋合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；QYC-2102C搖床上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Trace-MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國(guó)Finnigan公司；65 μm DVB-PDMS萃取頭美國(guó)Supelco公司。

2　方法

2.1　菌株的活化和接種數(shù)量的確定

將保藏菌株吸取50 μL的原菌液接入到含MSA液體培養(yǎng)基中活化2次測(cè)OD值。然后根據(jù)稀釋平板法事先做好每株菌種的OD值和其活菌落總數(shù)的曲線(xiàn)關(guān)系圖和曲線(xiàn)方程，算出的OD值所對(duì)應(yīng)的菌落總數(shù)。最后，菌體的濃度用無(wú)菌水調(diào)節(jié)至所需的濃度，待用[9]。

2.2　廣式臘腸加工工藝

2.2.1臘腸配方

肥肉和瘦肉之比為3∶7，背脂切成0.6 cm×0.6 cm小丁，其他輔料按肉的質(zhì)量添加，食鹽2%，糖13%，酒2%，亞硝酸鈉0.15%，水20%。菌株的接種量為106cfu/g。

2.2.2烘烤參數(shù)

分為3個(gè)階段：0～12 h 55 ℃(降溫通風(fēng)8 h)； 50 ℃ 16 h(降溫通風(fēng)8 h)；45 ℃ 24 h。

2.2.3對(duì)照組

僅添加150 mg/kg的亞硝酸鹽，不添加微生物。

2.2.4H+X組

添加106cfu/g的葡萄球菌H33B和微球菌X142B(1∶1)及150 mg/kg的亞硝酸鹽。

2.3　風(fēng)味成分的分析

2.3.1頂空固相微萃取(HS-SPME)法

固相微萃取頭的老化：65 μm DVB-PDMS萃取頭在氣相色譜進(jìn)樣口220 ℃老化4 h。

采用HS-SPME法對(duì)廣式臘腸揮發(fā)性成分的萃取。方法如下：臘腸樣品用小型食品攪拌機(jī)絞碎均勻后，迅速取60 g置于20 mL萃取瓶中，萃取頭插入萃取瓶并推出吸附纖維頭(不能接觸樣品)，60 ℃恒溫吸附30 min，然后縮回纖維頭，將針管退出樣品瓶，隨后插入氣相色譜儀進(jìn)樣口220 ℃解吸3 min。

2.3.2色譜條件

利用氣/質(zhì)(GC/MS)聯(lián)用儀(Trace GC/MS，F(xiàn)innigan)進(jìn)行風(fēng)味成分分析。氣相色譜條件為：毛細(xì)管柱：DB-1柱(30 m×0.32 mm；液膜厚度1 μm)；柱溫升溫程序：起始溫度45 ℃，保持5 min，然后以3 ℃/min的升溫速率升溫到80 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min的升溫速率升溫到180 ℃，保持4 min；汽化室溫度為220 ℃，載氣為He，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣方式：按分流比10∶1進(jìn)樣。

2.3.3質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(EI)，電子能量70 eV，燈絲發(fā)射電流200 μA，檢測(cè)器電壓為350 V，離子源溫度200 ℃，接口溫度220 ℃，掃描質(zhì)量范圍35～395 amu。

2.3.4風(fēng)味成分的鑒定

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理由Xcalibur軟件完成，未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索的同時(shí)與NIST譜庫(kù)(107000個(gè)化合物的數(shù)據(jù))和Wiley譜庫(kù)(320000個(gè)化合物的數(shù)據(jù)，Version 6.0)相匹配，只有當(dāng)正反匹配度均大于800(最大值為1000)的鑒定結(jié)果才予以確認(rèn)。同時(shí)利用Willey和NIST譜圖庫(kù)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)按峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析，求得各化學(xué)成分在廣式臘腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中的相對(duì)百分含量。

3　結(jié)果與討論

本試驗(yàn)中我們采用頂空固相微萃取的方法提取臘腸中的風(fēng)味物質(zhì)成分，然后利用氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)風(fēng)味物質(zhì)成分進(jìn)行定性和定量分析，考慮到試驗(yàn)的可行性我們只對(duì)臘腸成品的風(fēng)味進(jìn)行了分析。對(duì)照組廣式臘腸的GC/MS圖譜見(jiàn)圖1，H+X組廣式臘腸的GC/MS圖譜見(jiàn)圖2。

圖1　對(duì)照組廣式臘腸的GC/MS圖譜Fig.1 GC/MS chromatogram of control group of cantonese sausage

圖2　H+X組廣式臘腸的GC/MS圖譜Fig.2 GC/MS chromatogram of H+X group of cantonese sausage

所篩選微生物對(duì)風(fēng)味的影響見(jiàn)表1和表2。

表2　接種菌種對(duì)廣式臘腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響Table 2 Effects of inoculation of two strains on the flavor compounds in cantonese sausage

續(xù)　表

續(xù)　表

由表1可知，所篩選菌株對(duì)廣式臘腸的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有一定的影響，H+X組分離鑒定出廣式臘腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)56種，比對(duì)照組多了18種。其中從對(duì)照組鑒定出3種醇類(lèi)(42.22%)、14種酯類(lèi)(31.81%)、10種醛類(lèi)(22.19%)、8種烷烯烴及含氧衍生物類(lèi)(2.91%)、1種芳香族及其衍生物類(lèi)(0.66%)。從H+X組鑒定出5種醇類(lèi)(7.69%)、21種酯類(lèi)(76.96%)、10種醛類(lèi)(9.76%)、5種酸類(lèi)(1.97%)、2種酮類(lèi)(0.12%)、5種烷烯烴及含氧衍生物類(lèi)(0.62%)、5種芳香族及其衍生物類(lèi)(1.65%)。結(jié)果表明接種葡萄球菌和微球菌可以產(chǎn)生更多種的酯類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)和酮類(lèi)物質(zhì)，顯著提高了酯類(lèi)物質(zhì)的含量。

3.1　接種分離菌對(duì)醇類(lèi)物質(zhì)的影響

在醇類(lèi)物質(zhì)中以乙醇(ethanol)的含量最高，不同處理組的乙醇(ethanol)含量各有不同，例如對(duì)照組臘腸的乙醇占其總揮發(fā)性物質(zhì)的42.22%，而H+X臘腸只有其總揮發(fā)性成分的7.69%，除乙醇外(ethanol)，1-辛烯-3-醇(1-okten-3-ol)是兩組臘腸中共有的醇類(lèi)物質(zhì)，而異戊醇(3-Methyl-1-butanol)、2-硝基乙醇(2-nitro-Ethanol)、正庚醇(n-heptanol)、正辛醇(1-Octanol)只能在個(gè)別的臘腸中檢測(cè)出來(lái)。醇類(lèi)有清香、木香、脂肪香等香氣特征[10]，而且沸點(diǎn)低、揮發(fā)性好，可能對(duì)臘腸表香有一定的貢獻(xiàn)。另外醇類(lèi)物質(zhì)跟酸類(lèi)物質(zhì)結(jié)合生成酯類(lèi)物質(zhì)，對(duì)臘腸部分酯類(lèi)物質(zhì)的形成提供條件。許鵬麗[11]研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)級(jí)臘腸揮發(fā)物質(zhì)中乙醇占總揮發(fā)物的62.18%，一級(jí)臘腸的揮發(fā)物中乙醇占64.03%。廣式臘腸加工過(guò)程會(huì)加入2%(質(zhì)量比)的白酒，Sun等[12]也認(rèn)為酯類(lèi)和醇類(lèi)是廣式臘腸的主要風(fēng)味物質(zhì)。

3.2　接種分離菌株對(duì)酯類(lèi)物質(zhì)的影響

在所檢測(cè)酯類(lèi)物質(zhì)中，不同處理組臘腸酯類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)和含量差別很大。對(duì)照組的酯類(lèi)物質(zhì)主要以辛酸乙酯(Ethyl caprylate)和葵酸乙酯(Ethyl caprate)為主，分別占其總揮發(fā)性物質(zhì)的11.01%和8.51%；H+X組臘腸的酯類(lèi)物質(zhì)主要以乙酸乙酯(Heptanoic acid, ethyl ester)和異戊酸乙酯(Ethyl isovalerate)為主，分別占總揮發(fā)性物質(zhì)的35.31%和18.56%。辛酸乙酯有類(lèi)似白蘭地的香氣，并有甜味；乙酸乙酯有甜果香，微帶果香的酒香；異戊酸乙酯有水果、葡萄酒、蘋(píng)果的氣味。結(jié)果表明分離菌株可以提高臘腸中酯類(lèi)物質(zhì)含量。酯類(lèi)物質(zhì)對(duì)于臘腸的特征性風(fēng)味起重要的作用，可賦予臘腸果香和花香風(fēng)味，由長(zhǎng)鏈脂肪酸所形成的酯則會(huì)產(chǎn)生一種具有酯香特征的風(fēng)味[13]。臘腸中的酯類(lèi)揮發(fā)性成分主要是乙酯類(lèi)化合物，它們主要是來(lái)自于微生物的酯化作用。臘腸成熟過(guò)程中糖發(fā)酵、脂肪水解和氨基酸的氧化作用產(chǎn)生的酸與醇之間發(fā)生酯化生成酯類(lèi)物質(zhì)[14]。

3.3　接種分離菌對(duì)醛類(lèi)物質(zhì)的影響

由表1可知，醛類(lèi)物質(zhì)在對(duì)照組中含量為 22.19%，H+X組中含9.76%，低于對(duì)照組。己醛(Hexanal)、庚醛(Heptanal)、2-庚烯醛(2-Heptenal)、辛醛(Octanal)和E-2-辛烯醛((E)-2-Octenal)、壬醛(1-Nonanal)、十六烷醛(Hexadecanal)是兩組臘腸中共有的醛類(lèi)物質(zhì)，其他5種物質(zhì)只在個(gè)別產(chǎn)品中檢測(cè)到。鑒定出的醛類(lèi)物質(zhì)主要是直鏈的 5～9 個(gè)碳原子的醛類(lèi)物質(zhì)，Berdagué等人曾報(bào)道4～10個(gè)碳原子的直鏈醛是肉制品中對(duì)風(fēng)味有著重要貢獻(xiàn)的醛。兩組中都是己醛和壬醛的含量最高，己醛是亞油酸氧化的產(chǎn)物，一定程度上代表著脂肪氧化的程度。所鑒定出的醛類(lèi)物質(zhì)主要是中等相對(duì)分子質(zhì)量的醛類(lèi)和較高的相對(duì)分子質(zhì)量的醛類(lèi)，主要賦予的風(fēng)味是清香、奶油香、脂香和橘子皮香[15]，這些醛類(lèi)也許對(duì)廣式臘腸的風(fēng)味具有較大的貢獻(xiàn)。

3.4　接種菌株對(duì)酸類(lèi)物質(zhì)的影響

酸類(lèi)物質(zhì)在廣式臘腸中檢出種類(lèi)很少，一共有5種，只在H+X組檢出，H+X組還含有0.18%的L-乳酸，這是由于接種微生物發(fā)酵產(chǎn)生的。這也說(shuō)明酸類(lèi)物質(zhì)不是廣式臘腸的特征性風(fēng)味物質(zhì)。這也是廣式臘腸跟西式發(fā)酵腸不同的地方，西式發(fā)酵腸pH值較低，酸味較重。酸類(lèi)物質(zhì)能跟醇類(lèi)結(jié)合生成酯類(lèi)物質(zhì)，對(duì)酯類(lèi)物質(zhì)的生成有一定的貢獻(xiàn)。

3.5　接種菌株對(duì)酮類(lèi)物質(zhì)的影響

酮類(lèi)物質(zhì)只在H+X組臘腸中檢出且含量?jī)H為0.12%。多數(shù)的酮具有清香的氣味、或奶油味或果香味，由于酮類(lèi)物質(zhì)在廣式臘腸中的含量普遍較低，對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)不大。

3.6　接種菌株對(duì)其他揮發(fā)性物質(zhì)的影響

烷烯烴類(lèi)及含氧化合物在廣式臘腸中所占的比例一般在0.4%～2.91%范圍內(nèi)，正十五烷(Pentadecane)、十六烷(Hexadecane)這兩種烴是兩組臘腸中共有的烴類(lèi)物質(zhì)。廣式臘腸中所檢測(cè)的烷烴類(lèi)物質(zhì)的碳鏈都比較長(zhǎng)，主要是C13～C22。烯烴類(lèi)物質(zhì)在廣式臘腸檢出也極少。由于烴類(lèi)物質(zhì)的風(fēng)味閾值比較高，對(duì)廣式臘腸的風(fēng)味貢獻(xiàn)很小[16]。

芳香族類(lèi)化合物在廣式臘腸中存在比較多的有苯乙醛(Phenylacetaldehyde)、苯甲酸乙酯(Ethyl benzoate)、苯乙醇(Phenethyl alcohol)和苯乙酸乙酯(Ethyl phenylacetate)，其他類(lèi)的芳香族化合物只在個(gè)別臘腸中存在。芳香族化合物在廣式臘腸中含量在0.26%～1.65%之間，這也說(shuō)明芳香族類(lèi)化合物對(duì)廣式臘腸中的風(fēng)味貢獻(xiàn)也不大。芳香族化合物并不是來(lái)自肉制品本身，有可能來(lái)源于外界的污染，比如洗滌劑之類(lèi)的污染，也有可能來(lái)自于臘腸包裝物中高分子物質(zhì)的遷移[17]。

含氮類(lèi)、含硫類(lèi)、呋喃類(lèi)、酰胺類(lèi)等其他化合物在廣式臘腸中含量極少，固相靜態(tài)微萃取很難萃取到，所以檢測(cè)不出來(lái)。

4　結(jié)論

酯類(lèi)物質(zhì)是廣式臘腸風(fēng)味中的特征性物質(zhì)，酯類(lèi)物質(zhì)一般具有清甜而成熟的果香，同時(shí)還具有酒香的底韻，能掩蓋臘腸中肉的腥味，對(duì)臘腸的頭香有比較大的貢獻(xiàn)，給人一種非常愉快的酯香味，對(duì)臘腸的風(fēng)味貢獻(xiàn)非常大。其次是醇類(lèi)物質(zhì)，這主要跟廣式臘腸制作時(shí)添加了酒有關(guān)。再次是醛類(lèi)物質(zhì)烷烯烴及其含氧衍生物類(lèi)物質(zhì)、芳香族類(lèi)化合物和酮類(lèi)物質(zhì)，酸類(lèi)和含硫類(lèi)等其他類(lèi)化合物含量和種類(lèi)都極少。H+X組豐富了醇類(lèi)、醛類(lèi)和酮類(lèi)物質(zhì)，顯著提高酯類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)和含量，改善了廣式臘腸的風(fēng)味。接種組具有較好的風(fēng)味是由于添加菌種后，在微生物酶和內(nèi)源酶的作用下發(fā)生蛋白部分降解、脂肪降解和氧化，生成了更多的風(fēng)味物質(zhì)[18]。

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