金 淦 孟旭莉,# 劉小珍 李永峰 姚慶華 鄭慶輝 湯鴻超 錢佳誠 徐 超 芮鑫淼

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

2 浙江省立同德醫(yī)院 浙江 杭州 310012

3 浙江省腫瘤醫(yī)院 浙江 杭州 310022

4 浙江醫(yī)院 浙江 杭州310013

本研究以多西他賽耐藥的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231/DOX作為研究對象，觀察西黃丸含藥血清對乳腺癌耐藥細(xì)胞增殖、凋亡的影響，為臨床西黃丸聯(lián)合化療藥物治療乳腺癌提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及藥物：多西他賽耐藥的人乳腺癌細(xì)胞MDAMB-231/DOX獲贈于中山大學(xué)宋爾衛(wèi)教授實驗室。西黃丸購自北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠(批號：15042125)。

1.2 試劑與儀器：DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)液（美國HyClone公司，批號：AC10207065）；胎牛血清（美國Gibco公司，批號：15121250）；抗體（美國Proteintech公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0012）；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美國biouniquer公司，批號：7E070F6）；CCK-8試劑（日本同仁公司，批號：KM868）。流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司）；蛋白印記檢測系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞用含10%胎牛血清和100nmol/L多西他賽的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔2～3d傳代，細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期進(jìn)行實驗。

1.4 西黃丸含藥血清制備：西黃丸按0.6g/kg（MIDXHW），1.2g/kg（HIGHW）和給藥液10ml/kg，蒸餾水組為對照組（Wistar大鼠4周齡200g，同為雌性）進(jìn)行給藥；早晚各1次，連續(xù)7天。于末次給藥后1h（灌藥前12h禁食）,以20%烏拉坦10ml/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，無菌分離血清，經(jīng)過56℃，30min滅活后，置-80℃箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 MDA-MB-231/DOX細(xì)胞增殖檢測：采用CCK-8原液∶培養(yǎng)基=1∶9配置成CCK-8工作液加入MDA-MB-231/DOX細(xì)胞孔板中，孵育1.5h后，在波長450nm處讀取OD值。

1.6 MDA-MB-231/DOX細(xì)胞凋亡率檢測：收集MIDHW組、HIGHW組和對照組處理48小時的MDA-MB-231/DOX細(xì)胞，置于離心管中，800′rpm離心5min，去上清液，按照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒說明書操作，每管加入500μl緩沖液，依次加入5μl Annexin VFITC，5μl PI，室溫避光孵育10min，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.7 蛋白印跡法（Western blot）法檢測：MIDHW組、HIGHW組和對照組處理48h后，每孔加入100ul含1%蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，轉(zhuǎn)至于EP管中，12000′rpm離心10min，收集上清液。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。加入適量SDS上樣緩沖液于100℃金屬浴解交聯(lián)。取20μg蛋白樣品，10%SDS-PAGE電泳，將電泳分離的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，放入封閉液中室溫封閉1h，加入一抗4℃孵育過夜。次日洗膜，二抗室溫孵育1h，洗膜后，用蛋白印跡觀察，用圖像分析軟件測定各帶吸光度值作半定量分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法：所有實驗重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)用graphpad prism5.0進(jìn)行分析。兩樣本均數(shù)間比較用t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 西黃丸含藥血清有抑制MDA-MB-231/DOX細(xì)胞增殖的趨勢：MIDHW組、HIGHW組和對照組西黃丸含藥血清處理MDA-MB-231/DOX細(xì)胞48小時后。細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示見圖1。與對照組相比，MIDHW組和HIGXHW組增殖有受到抑制的趨勢，呈劑量依賴性。

圖1 西黃丸含藥血清有抑制多西他賽耐藥的MDA-MB-231/DOX細(xì)胞增殖活性的趨勢

2.2 西黃丸含藥血清有促進(jìn)MDA-MB-231/DOX細(xì)胞凋亡的趨勢：流式細(xì)胞儀檢測MIDHW組、HIGHW組和對照組細(xì)胞凋亡率。數(shù)據(jù)顯示，西黃丸含藥血清有促進(jìn)多西他賽耐藥的MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的趨勢。見圖2。與CTRL組相比，MIDHW組、HIGHW組的凋亡率逐漸升高（P＜0.01）。

圖2 西黃丸含藥血清有促進(jìn)多西他賽耐藥的MDA-MB-231/DOX細(xì)胞凋亡的趨勢。

2.3 西黃丸含藥血清增加Bax蛋白表達(dá)，抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)：MDA-MB-231/DOX細(xì)胞經(jīng)西黃丸含藥血清處理后，Western blot檢測Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表達(dá)。采用圖片處理軟件進(jìn)行半定量，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，Bcl-2蛋白的表達(dá)量在MIDHW組、HIGHW組分別減少了40.1%、54.8%（P＜0.01），呈劑量依賴性；而Bax蛋白的表達(dá)量在MIDHW組、HIGHW組分別增加了41.2%、71.3%（P＜0.01），呈劑量依賴性。實驗結(jié)果表明，西黃丸含藥血清增加MDA-MB-231/DOX細(xì)胞的Bax蛋白表達(dá)，抑制Bcl-2蛋白。見圖3。

圖3 西黃丸含藥血清促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)，并抑制Bcl-2蛋白

3 討論

本研究通過制備西黃丸含藥血清，觀察其對多西他賽耐藥的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231/DOX增殖的影響，發(fā)現(xiàn)西黃丸各組與對照組相比，細(xì)胞增殖能力有降低趨勢，并呈劑量依賴性。細(xì)胞凋亡實驗顯示，西黃丸含藥血清促進(jìn)多西他賽耐藥的MDA-MB-231/DOX細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞凋亡率隨西黃丸含藥血清劑量增加而升高，與增殖實驗結(jié)果相符。以上提示西黃丸有可能抑制了乳腺癌耐藥細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。并可促進(jìn)Bax表達(dá)，抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，提示西黃丸通過調(diào)控Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)，從而使MDA-MB-231/DOX細(xì)胞產(chǎn)生凋亡的趨勢，影響腫瘤細(xì)胞耐藥性。綜上，西黃丸有抑制乳腺癌MDA-MB-231/DOX細(xì)胞增殖的趨勢，并可能通過上調(diào)Bax蛋白表達(dá)、下調(diào)Bcl-2蛋白，促進(jìn)乳腺癌耐藥細(xì)胞的凋亡。然而，細(xì)胞增殖實驗中發(fā)現(xiàn)西黃丸含藥血清有抑制耐藥細(xì)胞增殖的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義；且凋亡實驗結(jié)果雖有統(tǒng)計學(xué)意義，但差異較小，故西黃丸對乳腺癌耐藥細(xì)胞的作用及其調(diào)控機制仍然需進(jìn)一步研究。