樓婷婷 余 平 孫萍萍 余永華

1 浙江省立同德醫(yī)院 浙江 杭州 310012

2 杭州新諾華醫(yī)藥有限公司 浙江 杭州 310015

清熱護(hù)肝方由葛根、梔子、芍藥、柴胡、枸杞、茵陳、五味子、板藍(lán)根、垂盆草、紫草組成，具有清熱解毒、保肝護(hù)肝的功效。其中葛根、梔子、芍藥是其重要成分。目前，未見同時(shí)測(cè)定清熱護(hù)肝方多個(gè)成分含量的報(bào)道。筆者采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定清熱護(hù)肝方葛根中活性成分葛根素、梔子中活性成分梔子苷和芍藥中活性成分芍藥苷的含量，并進(jìn)行方法學(xué)考察，以期為有效控制該制劑的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

島津LC-15C高效液相色譜儀；KQ5200超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）；十萬分之一電子天平（德國(guó)塞多利斯）。葛根素、梔子苷和芍藥苷的對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110752-200511、110749-200714、110736-201337）；水 為 過0.22μm濾膜的純水，乙腈為色譜純，其余試劑均為分析醇。清熱護(hù)肝方飲片均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠提供，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院專家鑒定合格。

2 方法[1-4]和結(jié)果

2.1 色譜條件：流動(dòng)相為乙腈-水（16∶84），色譜柱為HypersilBDSC18（4.6mm× 250mm，5μm），流 速 為1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm。進(jìn)樣量為20μl。理論板數(shù)按葛根素、梔子苷和芍藥苷計(jì)算均在4000以上，分離度均＞1.5。對(duì)照品、樣品、陰性樣品色譜見圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備：分別取葛根素對(duì)照品約17mg、梔子苷對(duì)照品約10mg和芍藥苷約14mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備：按照處方，調(diào)配混合研細(xì)，精密稱取細(xì)粉適量約500mg，置50ml容量瓶中，加甲醇25ml，超聲提取40min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液即得。

圖1 對(duì)照品(A)、樣品(B)、陰性樣品(C)HPLC色譜圖

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備：以相同處方比例，制得不含葛根、梔子、芍藥的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成空白對(duì)照溶液。

2.5 線性關(guān)系考察：分別精密量取濃度為170μg/ml的葛根素對(duì)照品溶液、100μg/ml的梔子苷對(duì)照品溶液、140μg/ml的芍藥苷對(duì)照品溶液適量，加甲醇配成濃度為 0.002、0.004、0.006、0.008、0.010、0.012μg/ml的系列葛根素對(duì)照品溶液，0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006μg/ml的系列梔子苷對(duì)照品溶液，0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008μg/ml 的系列芍藥苷對(duì)照品溶液。按上述色譜條件測(cè)定峰面積，并以峰面積（Y）對(duì)濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得線性方程：Y=2109500X+15080，r=0.9999；Y=29589000X-72694，r=0.9998；Y=1976500X-5798，r=0.9999。結(jié)果表明葛根素在0.002～0.012μg/ml，梔子苷在0.001～0.006μg/ml，芍藥苷在0.003～0.008μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取供試品溶液，按色譜條件，分別于0h、2h、4h、6h、8h、12h進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算供試品溶液葛根素、梔子苷和芍藥苷的峰面積RSD。得葛根素、梔子苷和芍藥苷峰面積的RSD分別為0.70%，0.93%，1.05%，表明樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD。得葛根素、梔子苷和芍藥苷峰面積的RSD分別為0.44%，0.61%，0.89%（n=6），結(jié)果表明本法精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)：稱取同一批次樣品6份，按供試品溶液制備方法制備供試液并依法測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示葛根素、梔子苷和芍藥苷含量的RSD分別為1.61%，1.79%，1.47%（n=6），結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)：取已知含量的清熱護(hù)肝方（含葛根素0.685mg/g、梔子苷0.396mg/g和芍藥苷0.548mg/g）樣品適量，研細(xì)，取9份，每份約250mg，置50ml量瓶中，精密加入對(duì)照品溶液1ml，加甲醇22ml，超聲處理40min，放冷至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1～表3。

表1 葛根素加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n=9）

表2 梔子苷加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n=9）

表3 芍藥苷加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n=9）

2.10 樣品的測(cè)定：按供試品溶液項(xiàng)下制備方法和色譜條件對(duì)3批樣品中葛根素、梔子苷和芍藥苷進(jìn)行分析，計(jì)算含量，結(jié)果見表4。

表4 每片樣品中各成分含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

本法采用乙睛-水進(jìn)行洗脫，簡(jiǎn)便方便，基線平穩(wěn)。分別對(duì)比例為13.5∶86.5、16∶84、17∶83進(jìn)行考察，隨著乙睛比例的升高，保留時(shí)間縮短，但葛根素分離不完全，流動(dòng)相的比例為16∶84時(shí)，分離效果較好。葛根素最大吸收波長(zhǎng)為250nm，梔子苷最大吸收波長(zhǎng)為240nm，芍藥苷最大吸收波長(zhǎng)為230nm，梔子苷色譜峰面積比芍藥苷和葛根素大很多，在230nm處三個(gè)吸收峰均較好，兼顧三種成分的同時(shí)測(cè)定靈敏度，選擇230nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。本文HPLC法同時(shí)測(cè)定清熱護(hù)肝方中葛根素、梔子苷和芍藥苷的含量方法可行，結(jié)果精密度高，重現(xiàn)性好，樣品回收率好，可為該制劑質(zhì)量控制提供依據(jù)。

[1]陳蕊，陳民輝，蔡梅，等.HPLC校正因子法同時(shí)測(cè)定葛根素及其各種注射劑中的5種有關(guān)物質(zhì)[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36(13)：1744-1750.

[2]廖艷華，韓鋒，馬莉，等.高效液相色譜法測(cè)定梔丹安神顆粒中梔子苷[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2013，28(2)：191-193.

[3]馬躍海，鄭霞，鄒桂欣.高效液相色譜法測(cè)定冠脈康膠囊葛根素含量[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2013，27(6)：40-42.

[4]劉春海，張妮瑜，歐金秀.HPLC測(cè)定烏雞白鳳丸（水蜜丸）中芍藥苷含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008，14(12)：13-15.