胡雪芳　田志清　梁　亮　張志民　王士奎

(1.農(nóng)業(yè)部規(guī)劃設(shè)計研究院， 北京 100125； 2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)后處理重點實驗室， 北京 100121)

0　引言

鈣是人體必需營養(yǎng)元素之一，參與人體的整個生命過程[1-2]，我國以植物性膳食為主，補鈣是我國膳食營養(yǎng)研究中的重要課題[3]。在實際飲食中鈣含量十分充足的情況下，缺鈣仍是普遍發(fā)生的問題，這是因為僅補充鈣量達標(biāo)是不行的，還需要將鈣轉(zhuǎn)化為可吸收的形式。目前常見補鈣制劑如碳酸鈣等無機鈣及檸檬酸鈣、葡萄糖酸鈣等有機鈣，由于其生物效價低、溶解性差，人體對其的吸收利用率有限。另外，人體吸收環(huán)境過酸，腸道對Ca2+的通透性差等對鈣的吸收也有著重要影響。因此開發(fā)一種具有多重功能的螯合鈣制劑具有重要意義。

目前鈣螯合制劑作為廣大學(xué)者的研究熱點，其制備原料、制備方法豐富多樣，產(chǎn)品也有很多種[4-8],其研究主要是從農(nóng)漁產(chǎn)品加工副產(chǎn)物綜合利用角度出發(fā)，開發(fā)肽-鈣、氨基酸-鈣螯合物，有相當(dāng)一部分都是粗品，其成分和作用機制復(fù)雜，且作為動物性蛋白質(zhì)存在潛在過敏原，產(chǎn)品純化難度大，產(chǎn)品檢測、安全管理等難以形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，另外人體對氨基酸類的需求是有一定數(shù)量和比例要求的，多肽及氨基酸類螯合鈣制劑的長期服用對其他代謝途徑、生理功能也存在潛在影響[9]。

殼寡糖(COS)是殼聚糖經(jīng)過降解以后得到的聚合度2～20的產(chǎn)物，不僅具有與殼聚糖相似的性質(zhì)，而且水溶性大大提高，且更容易被吸收，一些生理活性也更加顯著，具有提高機體免疫、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂、促進雙歧桿菌的生長、調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生物的代謝活動等功能[10]，尤其在促進成骨細(xì)胞增殖、增加骨密度、促進骨折愈合、提高骨骼再建能力等骨關(guān)節(jié)疾病領(lǐng)域具有獨特應(yīng)用價值[11]。6-羧基殼寡糖(CCOS)是殼寡糖分子第6位羥基直接羧基化后生成的一種殼寡糖衍生物，其分子中除了含有—OH和—NH2外，還有—COOH，是一種兩性電解質(zhì)，液態(tài)下粘度小，除具有與殼寡糖相似生理功能外，還能有效提高殼寡糖絡(luò)合金屬離子的能力。本文通過TEMPO催化氧化法制備6-羧基殼寡糖，利用該分子特性，與Ca2+形成穩(wěn)定絡(luò)合體系，制備CCOS-Ca(Ⅱ)配合物，使Ca2+隨之進入機體，同時改善Ca2+的人體吸收環(huán)境，充分發(fā)揮殼寡糖和鈣金屬離子對人體雙重營養(yǎng)功能特性，探究其合成的最佳工藝條件，對其進行紅外表征和元素分析，探討其配位機理，旨在為開發(fā)殼寡糖基金屬配合物和高效補鈣制劑提供新的思路，為進一步研究殼寡糖及金屬配合物在醫(yī)藥保健食品以及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1　試驗材料與方法

1.1　材料與設(shè)備

原材料：殼寡糖(分子量500～1 500，脫乙酰度90%以上，山東奧康生物科技有限公司)，CaCl2(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；無水乙醇(分析純，天津市化學(xué)試劑有限公司)；NaOH(分析純，天津市百世化工有限公司)；TEMPO (Sigma 公司)；HCI、Na2SO3、NaClO、NaBr(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；EDTA(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；TEOA(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；鈣指示劑(分析純，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠)。

主要設(shè)備：FA1204B型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司)；TGL-16C型離心機(上海安寧科學(xué)儀器)；冷凍干燥機(北京博醫(yī)康試驗儀器有限公司)；GZX-GF-MBS-1型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器(上海躍進醫(yī)療器械廠)；PHS-25型PH計(上海精密雷磁)；Perkin-Elmer 2400型元素分析儀(美國PE公司)；AA300型原子吸收分光光度計 (美國Perkin Elmer公司)；Nicolet 6700型傅里葉紅外光譜儀(美國Perkin Elmer公司)。

1.2　試驗方法

1.2.16-羧基殼寡糖的制備

在500 mL三口燒瓶中加入200 mL蒸餾水和10 g殼寡糖，充分溶解，低溫浴槽控制體系溫度10℃，加入1 g TEMPO和5 g NaBr，通過滴液漏斗以1～2滴/s的速度滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%(基于殼寡糖質(zhì)量)的NaClO溶液，并滴加0.5 mol/L的NaOH溶液維持反應(yīng)介質(zhì)的pH值在10～10.5之間，反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入適量飽和Na2SO3溶液終止反應(yīng)，靜置片刻，將混合液攪拌加入到乙醇中沉淀，過濾，并使用去離子水充分濾洗氧化產(chǎn)物至中性；所得6-羧基殼寡糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在95%以上。在50℃下真空干燥后，4℃條件下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2螯合率測定方法

CCOS和CaCl2在一定條件下反應(yīng)一定時間后，移取一定量的反應(yīng)液兩份，一份稀釋后直接用0.05 mol/L的EDTA溶液滴定(不需要標(biāo)定)，記錄所消耗EDTA體積V0，另一份蒸干，加入無水乙醇進行振蕩洗滌，分離出乙醇后加水溶解，再 EDTA滴定，消耗體積記錄為V1。

螯合率計算公式為

a=V1/V0×100%

1.2.36-羧基殼寡糖螯合鈣的工藝流程

工藝流程為：一定質(zhì)量比的CCOS和CaCl2→溶于200 mL去離子水中→攪拌→調(diào)節(jié)溶液pH值(pH值3～10)→一定溫度下反應(yīng)(40～80℃)一定時間→乙醇沉淀(乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%以上，靜置3 h)→離心并收集沉淀(8 000 r/min，15 min)→溶解沉淀物并透析→冷凍干燥(-26℃預(yù)凍，工作壓力100～110 Pa，升華溫度45～55℃)→CCOS-Ca(Ⅱ)成品→測定螯合率。

1.2.4單因素試驗

據(jù)對殼寡糖(氨基酸、多肽)對金屬離子(鈣、鐵、鋅等)螯合工藝參數(shù)的相關(guān)研究，影響合成反應(yīng)的主要因素有：pH值、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、配體質(zhì)量比等。

(1)固定反應(yīng)溫度在40℃，反應(yīng)時間30 min， CCOS與CaCl2質(zhì)量比為10，pH值2、4、6、8、10、12，考察pH值對螯合率的影響。

(2)固定反應(yīng)pH值在8，反應(yīng)時間30 min，CCOS與CaCl2質(zhì)量比為10，反應(yīng)溫度分別為30、40、50、60、70、80℃，考察反應(yīng)溫度對螯合率的影響。

(3)固定反應(yīng)溫度在50℃、pH值在8，CCOS與CaCl2質(zhì)量比為10，反應(yīng)時間20、40、60、80、100、120 min，考察反應(yīng)時間對螯合率的影響。

(4)固定反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時間60 min，反應(yīng)pH值為8，CCOS與CaCl2質(zhì)量比分別為5、10、15、20、25、30，考察質(zhì)量比對螯合率的影響。

1.2.5響應(yīng)面法優(yōu)化螯合工藝

采用三因素五水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗，選取體系pH值、反應(yīng)溫度、CCOS與CaCl2質(zhì)量比3個因素，設(shè)計二次通用回歸試驗。試驗設(shè)計如表1所示。

表1　中心組合設(shè)計各因素編碼Tab.1　Range of different factors investigated with CCRD design

1.2.66-羧基殼寡糖螯合鈣紅外光譜分析

取樣品5 mg，與500 mg的KBr一起放入干燥的研缽中，在紅外燈下混合研磨均勻，使其顆粒粒徑在2.5pm以下，裝入壓片模具，制得透明的KBr樣品片。利用傅里葉紅外光譜儀進行定性分析，在4 000～500 cm-1條件下掃描得到光譜圖。按同樣方法對6-羧基殼寡糖進行紅外光譜測定。

1.2.7元素分析

用元素分析儀分別檢測樣品中C、H、N的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，用原子吸收分光光度計測定Ca2+的含量。

1.3　數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果測定3次，用Sigma Plot 12.5進行數(shù)據(jù)處理與制圖，Design-Expert(Version 8.0.6，美國，Stat-Ease公司)軟件對試驗數(shù)據(jù)進行擬合與統(tǒng)計分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　單因素試驗

(1)pH值

由圖1可知，pH 值對于螯合率有較大影響，在酸性條件下，螯合率隨著pH值的升高而迅速升高，而當(dāng)體系pH值大于8，螯合率隨著體系pH值升高而緩慢下降。究其原因，在酸性條件下，溶液中H+大量存在，H+將會與Ca2+爭奪供電子基團，—COOH的離解受到抑制，—COO-減少，且—NH2容易被質(zhì)子化，氨基及羧基配位能力較弱，不利于螯合物的形成；隨著pH值的增加，—COOH的離解增加，—COO-對Ca2+的絡(luò)合作用增強，而在堿性條件下(pH值大于8)，OH-與供電子基團爭奪Ca2+而形成羥橋化物，生成了氫氧化鈣沉淀[12]，且H+對螯合率的影響大于OH-的作用，在相對中性條件下，配體受 H+和OH-影響較小，提供了充分的供電子基團，從而有利于鈣通過配位鍵形成螯合物。本試驗在pH值為8時，螯合率與螯合物中鈣的含量最高。優(yōu)化試驗中，選取pH值8作為設(shè)計中點。

圖1　pH值對螯合率的影響Fig.1　Effect of pH value on rate of chelation rate

(2)體系溫度

由圖2可知，隨著反應(yīng)溫度的增加，產(chǎn)物螯合率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，螯合率在50℃達到最大，此后隨著溫度的升高，螯合率和螯合物中鈣含量逐漸降低。分析原因，可能是由于該螯合反應(yīng)為放熱反應(yīng)，適當(dāng)升高溫度能夠促進反應(yīng)的進行，但提高過度會使反應(yīng)逆向進行，溫度過高，使聚合物分解或使螯合物解離[13]，在優(yōu)化試驗中，選擇50℃為反應(yīng)體系溫度設(shè)計中點。

圖2　反應(yīng)溫度對螯合率的影響Fig.2　Effect of reaction temperature on rate of chelation rate

(3)反應(yīng)時間

由圖3可知，選取的反應(yīng)時間范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)時間的延長，螯合率變化趨勢不明顯，采用SPSS 19.0進行方差分析結(jié)果顯示，在60～100 min時間范圍內(nèi)，反應(yīng)時間對螯合率影響差異不顯著(p<0.01)，螯合率雖然隨著時間的改變有上下浮動，應(yīng)屬于隨機波動，無統(tǒng)計學(xué)意義，在100 min后螯合率顯著下降，這是由于隨著反應(yīng)時間的延長，一部分螯合物不穩(wěn)定被分解?？傮w上反應(yīng)時間對螯合率影響不大，在響應(yīng)面試驗中固定在60 min。

圖3　反應(yīng)時間對螯合率的影響Fig.3　Effect of reaction time on chelation rate

(4)CCOS與CaCl2質(zhì)量比

配體質(zhì)量比是指配位體與金屬離子的質(zhì)量之比，是影響鰲合反應(yīng)的一個重要因素。配位比過高,會使6-羧基殼寡糖的利用率下降，配位體過低，鰲合物不穩(wěn)定。由圖4可以看出，CCOS與CaCl2質(zhì)量比對螯合率有非常顯著的影響，隨著質(zhì)量比的不斷增加螯合率不斷升高，當(dāng)質(zhì)量比為25時，產(chǎn)物螯合率在85%左右，且此時鈣源和6-羧基殼寡糖的利用率都比較高，當(dāng)質(zhì)量比進一步增加，螯合率升高的趨勢并不明顯。說明增大配位比可以推動螯合反應(yīng)向有利的方向進行，但過大的配位比顯然會造成配體的浪費。因此，選擇CCOS與CaCl2質(zhì)量比25作為優(yōu)化試驗中質(zhì)量比設(shè)計中點。

圖4　CCOS與CaCl2質(zhì)量比對螯合率的影響Fig.4　Effect of CCOS and CaCl2 mass ratio on chelation rate

2.2　試驗結(jié)果

試驗方案設(shè)計與結(jié)果如表2所示，表中A、B、C分別為pH值、反應(yīng)溫度、CCOS與CaCl2質(zhì)量比的編碼值。

表2　試驗方案與結(jié)果Tab.2　CCRD experiment design and response values

2.3　模型的建立與檢驗

利用Design-Expert 8.0.6數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對試驗結(jié)果進行方差統(tǒng)計分析，結(jié)果如表3所示。

由表3的方差分析可以看出，回歸模型高度顯著(p<0.001)，模型R2=0.945 5，矯正R2=0.920 9，說明模型擬合良好；模型失擬項表示模型預(yù)測值與實際值不擬合的概率，表3中模型失擬項的p值大于0.05表明模型失擬項不顯著，回歸方程能較好地解釋響應(yīng)結(jié)果并預(yù)測最佳螯合工藝條件，圖5～7直觀地反映了各因素對CCOS-Ca(Ⅱ)螯合率的影響。

表3　螯合率回歸方程方差分析Tab.3　Variance analysis of chelating rate

注：** 表示極顯著，-表示不顯著。

圖5　反應(yīng)溫度和pH值對螯合率的影響Fig.5　Effect of reaction temperature and pH value on chelation rate

圖6　CCOS與CaCl2質(zhì)量比和pH值對螯合率的影響Fig.6　Effect of pH value and mass ratio on chelation rate

圖7　CCOS與CaCl2質(zhì)量比和反應(yīng)溫度對螯合率的影響Fig.7　Effect of reaction temperature and mass ratio on chelation rate

從表3回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知，該模型A、B、C、A2、B2、C2、AB、BC對產(chǎn)品螯合率的影響均達到了極顯著的水平(p<0.01)，而AC(p=0.919 8)對螯合率的影響作用不顯著。在試驗的范圍內(nèi)，對CCOS-Ca(Ⅱ)螯合率的影響從大到小依次為：pH值、質(zhì)量比、反應(yīng)溫度。根據(jù)方差分析和回歸方程系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果，將差異不顯著因子剔除后的回歸方程為

Y=88.89+5.02A-3.30B+4.96C-3.09AB+
4.51BC-8.86A2-5.37B2-2.70C2

得到CCOS-Ca(Ⅱ)螯合率與真實值之間關(guān)系的回歸方程為

Y=-730.77+161.98P+6.39T-0.48NP+
0.05TN-8.85P2-0.05T2-0.03N2

模型預(yù)測最高螯合率為91.91%，對應(yīng)pH值為8.29，溫度為49.97℃，CCOS與CaCl2質(zhì)量比為34.24，考慮到實際操作的簡便性，將參數(shù)修正為：pH值8.3，反應(yīng)溫度50℃，CCOS與CaCl2質(zhì)量比34。在此優(yōu)化后工藝條件下，驗證試驗螯合率為88.86%，驗證試驗值與預(yù)測值誤差較小，不存在顯著性差異(p>0.05)，說明優(yōu)化試驗較為成功。驗證試驗值與預(yù)測值誤差較小，說明模型擬合較好。

2.4　CCOS-Ca(Ⅱ)紅外光譜分析

圖8　CCOS和CCOS- Ca(Ⅱ)紅外光譜圖Fig.8　Infrared spectra of CCOS and CCOS- Ca(Ⅱ)

2.5　螯合物元素分析

表4列出了6-羧基殼寡糖、6-羧基殼寡糖合鈣的元素分析數(shù)據(jù)?？捎嬎愠?-羧基殼寡糖分子中各個元素的原子個數(shù)比為5.95∶9.16∶1∶8.16,單元殘基的分子組成接近于C6H9O5N, 6-羧基殼寡糖螯合鈣各個原子數(shù)比為11.75∶18.41∶1.97∶1，由此可推算出配合物中6-羧基殼寡糖與Ca2+的大致配位比為2∶1，即相當(dāng)于6-羧基殼寡糖分子中的2個氨基葡萄糖單元殘基與1個Ca2+配位。

表4　螯合物的元素分析Tab.4　Elements analysis of 6-carboxy-chitooligosaccharide chelated calcium　%

3　討論

殼寡糖/殼聚糖及其衍生物中因存在著有良好配位能力的氨基和羥基以及羧基，對金屬具有良好的配位作用。以殼寡糖或者改性殼寡糖為基體絡(luò)合金屬離子所得金屬配合物材料具有許多獨特的物理、化學(xué)性質(zhì)，比如抗氧化[19-20]、抗菌[21]、脫除動物體內(nèi)重金屬[22-23]等功能，另外殼寡糖及其衍生物良好的生物相容性和可降解性使其有望成為人體微量元素鈣、鐵、鋅等的補給劑[24-26]。為了提高殼寡糖對金屬離子的吸附、螯合能力，近年來有學(xué)者通過引入羧基對其改性，楊華[24]研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖改性后所得的羧甲基殼寡糖對鋅的吸附能力明顯提高，許聰?shù)萚25]、許才利等[26]研究發(fā)現(xiàn)，羧甲基殼寡糖對稀土元素釓和金屬元素鐵的絡(luò)合能力強于殼寡糖且熱穩(wěn)定性更好。

本研究通過直接對殼寡糖C6位羥甲基氧化生成羧基，較引入乙酸對其進行羧基化改性工藝更具經(jīng)濟性，經(jīng)過螯合工藝優(yōu)化后，通過元素分析初步推斷CCOS與Ca2+摩爾比為2∶1，即2個CCOS分子螯合1個Ca2+，高于田金花等[27]、王金明等[28]研究中殼寡糖對同樣價態(tài)的鋅離子的絡(luò)合能力。本文研究發(fā)現(xiàn)CCOS對金屬的配位能力受體系pH值影響最為顯著，在pH值相對中性條件下螯合率較高，體系過酸，H+過多，影響—NH2和—COOH在體系中的存在狀態(tài)，進而影響螯合產(chǎn)物的形成，而體系過堿，OH-過多而與鈣形成沉淀，而降低螯合率，劉艷如等[29]也研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖與金屬鈣離子發(fā)生配位反應(yīng)時，當(dāng)溶液的pH值呈酸性時，溶液中的—NH3+濃度增大，—NH2濃度減小，平衡朝鋅絡(luò)合物解離方向移動；螯合率受體系溫度的影響也較為明顯，反應(yīng)溫度50℃附近，螯合產(chǎn)物最為穩(wěn)定，溫度過高會使得已經(jīng)形成的螯合物發(fā)生解離；受反應(yīng)時間影響不顯著，螯合過程迅速，這與趙麗娜等[30]、桑亞新等[31]研究結(jié)果一致，本文研究所得最高螯合率為88.86%，高于骨膠原、多肽、氨基酸等[4-5,14-15,32]對鈣離子的螯合能力。

4　結(jié)論

(1)利用殼寡糖(COS)制備6-羧基殼寡糖(CCOS)，將殼寡糖C6位上的羥甲基直接氧化成為羧基，研究了CCOS對鈣離子的絡(luò)合性能，考察了體系pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、CCOS與CaCl2質(zhì)量比對螯合率的影響規(guī)律，研究結(jié)果表明，體系pH值、反應(yīng)溫度對螯合率影響顯著，反應(yīng)時間對螯合率影響不顯著。

(2)通過中心復(fù)合旋轉(zhuǎn)設(shè)計優(yōu)化確定了CCOS-Ca(Ⅱ)制備的最終工藝參數(shù)為：反應(yīng)pH值為8.3，反應(yīng)時間60 min，反應(yīng)溫度50℃，CCOS與CaCl2質(zhì)量比為34。在此優(yōu)化工藝條件下，驗證試驗螯合率為88.86%。方差分析與檢驗結(jié)果表明，pH值、反應(yīng)溫度、CCOS與CaCl2質(zhì)量比以及3個因素的平方項，pH值和反應(yīng)溫度、pH值和質(zhì)量比的交互作用對產(chǎn)品螯合率的影響均達到了極顯著的水平(p<0.01)。

(3)對產(chǎn)物進行傅里葉變換紅外光譜掃描及元素分析，結(jié)果表明，螯合前后兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)上存在一定的變化，較好地證明了鈣螯合物的形成，CCOS-Ca(Ⅱ)配合物的的結(jié)構(gòu)初步認(rèn)為CCOS與Ca2+摩爾比為2∶1。

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