劉浩坤，潘永福，周 敏，王運(yùn)來，尹丹丹，許 釩

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012)

肝硬化腹水是諸多肝臟疾病的常見并發(fā)癥，是由肝功能減退、門靜脈高壓導(dǎo)致肝脾腫大，機(jī)體無法吸收蛋白質(zhì)和維生素而在體液中形成高滲環(huán)境，導(dǎo)致腹腔積水增多引起的惡性疾病。該病主要臨床表現(xiàn)為腹脹、腹壁靜脈曲張、食管胃底靜脈曲張等，其中肝門靜脈高壓在肝硬化腹水的形成中起主導(dǎo)作用[1]。肝門靜脈高壓的形成系肝內(nèi)血流阻力以及門靜脈血流量增加所導(dǎo)致的。研究表明，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)參與肝纖維化細(xì)胞外基質(zhì)和肝臟微循環(huán)調(diào)節(jié)，其中RhoA/ROCK信號通路能夠活化HSCs[2-5]，而活化后的HSCs在肝門靜脈高壓形成過程中起重要作用[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，RhoA/ROCK通路激活后，可使肝內(nèi)血管阻力增大，抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的活性，刺激HSCs收縮，加速肝硬化靜脈高壓的形成[8-9]。

當(dāng)歸芍藥散(Danggui Shaoyao San，DSS)出自張仲景《金匱要略》，由當(dāng)歸、芍藥、川芎、白術(shù)、茯苓、澤瀉6味藥組成，具有活血利水之功效。研究表明，DSS可通過保護(hù)肝細(xì)胞、抗肝損傷作用而改善門靜脈循環(huán)障礙、增強(qiáng)免疫功能和促進(jìn)利尿等[10-12]。本研究擬考察DSS含藥血清對內(nèi)皮素-1(endothelin，ET-1)介導(dǎo)的HSCs中RhoA/ROCK Ⅱ和eNOS蛋白表達(dá)的影響，探討其機(jī)制，為該藥治療肝硬化腹水提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 DSS組方藥材購于安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司，并經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院金傳山教授鑒定，均符合《中華人民共和國藥典》(2015年版)項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)。參照原方比例(當(dāng)歸3 g，芍藥16 g，川芎8 g，白術(shù)、茯苓各4 g，澤瀉8 g)稱取藥材，醇提濃縮制備所含生藥濃度為1.72 g/mL的DSS提取液。

1.2 細(xì)胞株及動物 大鼠HSC-T6細(xì)胞株購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。該細(xì)胞株系SV40轉(zhuǎn)染SD大鼠HSCs而成，表型為活化的HSCs。健康雄性SD大鼠，200～220 g，購自安徽省實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK(皖)2011-002。

1.3 主要試劑 高糖培養(yǎng)基：Hyclone公司；胰酶消化液：碧云天生物技術(shù)研究所；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)：北京中杉生物技術(shù)有限公司；Y27632(ROCK抑制劑)：上海前塵生物科技有限公司；脫脂奶粉：上海光明乳品有限公司；電化學(xué)發(fā)光試劑盒：Thermo公司；BCA(bicinchoninic acid)蛋白濃度測定試劑盒：碧云天生物技術(shù)研究所；十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine,TEMED)：Sigma；NaCl：上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；甘氨酸：Solarbio；PVDF膜：Millipore公司；預(yù)染蛋白Marker：Thermo；過硫酸胺、丙烯酰胺：sigma；RhoA(兔多抗)、ROCK Ⅱ(兔多抗)：Abcam公司；eNOS(兔多抗)：Santa cruz。

1.4 主要儀器 滅菌鍋：日本Tomy KOQYO公司；多功能酶標(biāo)儀：美國MD公司；超凈工作臺(YJ-1450)：蘇凈集團(tuán)安泰公司；干燥箱：上海一恒科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱：日本Sanyo公司；AF-10型自動制冰機(jī)：意大利SCOTSMAN；VE-186型轉(zhuǎn)膜儀、VE-180電泳槽、EPS300型電泳儀：Tanon；X膠片：Kodak；TS-1000水平搖床：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；純水機(jī)：美國SIM。

2 方法

2.1 含藥血清的制備 取20只健康雄性SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為兩組：空白組和給藥組。給藥組以10 mL/kg給藥劑量每日灌胃DSS提取液2次(早晚各1次)，連續(xù)3 d；空白組給予等劑量的生理鹽水。末次給藥1 h后，腹腔注射3.5%水合氯醛(10 mL/kg)麻醉，于無菌狀態(tài)下腹主動脈采血，37 ℃靜置1 h后，3 500 r/min離心10 min，將相同條件下所采血清混和，56 ℃、30 min滅活，以除去可能存在的生物活性物質(zhì)，再用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，密封后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。同時以生理鹽水制備的正常大鼠血清作對照。將冷凍保存于液氮中的HSCs復(fù)蘇后接種于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、鏈霉素100 U/mL和青霉素100 U/mL)，37 ℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞呈單層致密狀時，2.5 g/mL胰蛋白酶消化后傳代。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)均在呈指數(shù)生長的細(xì)胞中進(jìn)行?？瞻捉M：無血清DMEM培養(yǎng)基+空白大鼠血清(終濃度為10%)；模型組：無血清DMEM培養(yǎng)基+空白大鼠血清(終濃度為10%)+ET-1(終濃度為10 nmol/L)；DSS含藥血清低劑量組：無血清DMEM培養(yǎng)基+DSS含藥血清(終濃度為5%)+ET-1(終濃度為10 nmol/L)；DSS含藥血清中劑量組：無血清DMEM培養(yǎng)基+DSS含藥血清(終濃度為10%)+ET-1(終濃度為10 nmol/L)；DSS含藥血清高劑量組：無血清DMEM培養(yǎng)基+DSS含藥血清(終濃度為15%)+ET-1(終濃度為10 nmol/L)；Y-27632抑制劑組：無血清DMEM培養(yǎng)基+Y-27632(終濃度為100 μmol/L)+ET-1(終濃度為10 nmol/L)。

2.3 Western blot法檢測 將上述分組的細(xì)胞處理后每瓶加含有苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)(100 mmol/L)的裂解液約400 μL，冰浴下充分裂解細(xì)胞，細(xì)胞裂解液于4 ℃、12 000 r/min條件下離心5 min，將離心后的上清液分裝轉(zhuǎn)入1.5 mL的離心管中于-20 ℃保存。用考馬斯亮藍(lán)G250染色測定蛋白濃度后，以每孔含25 μg蛋白的溶液為上樣量，SDS-PAGE凝膠(12%分離膠、5%濃縮膠)電泳(120 V/60 V)，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜(NC膜)，5%脫脂奶粉于室溫下脫色搖床上搖動封閉4 h，封閉后加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，PBST(PBS+吐溫-20)洗膜3遍，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液(1∶50 000)室溫孵育2～3 h后，洗膜，化學(xué)發(fā)光法顯影。將照片進(jìn)行掃描或拍照，將目的條帶的分子量和凈光密度值用Bio-Rad凝膠圖像處理系統(tǒng)分析。

3 結(jié)果

3.1 DSS含藥血清對ET-1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞內(nèi)RhoA、ROCKⅡ蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)RhoA、ROCKⅡ蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，DSS含藥血清高、中、低劑量組及Y-27632抑制劑組均可顯著下調(diào)RhoA蛋白表達(dá)(P<0.05)，DSS含藥血清高、中、低劑量組可不同程度下調(diào)ROCK Ⅱ蛋白表達(dá)，其中高、中劑量組顯著下調(diào)ROCKⅡ蛋白的表達(dá)(P<0.05)；Y-27632抑制劑組可顯著抑制下調(diào)RhoA、ROCK Ⅱ蛋白的表達(dá)(P<0.05)。見圖1。

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；A.空白組；B.模型組；C.DSS含藥血清低劑量組；D.DSS含藥血清中劑量組；E.DSS含藥血清高劑量組；F.Y-27632抑制劑組

3.2 DSS含藥血清對ET-1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞內(nèi)eNOS蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)eNOS蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，DSS含藥血清高、中、低劑量組均可上調(diào)eNOS蛋白表達(dá)水平，且呈現(xiàn)一定劑量依賴性，其中高、中劑量組上調(diào)eNOS表達(dá)作用顯著(P<0.05)。見圖2。

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；A.空白組；B.模型組；C.DSS含藥血清低劑量組；D. DSS含藥血清中劑量組；E.DSS含藥血清高劑量組

4 討論

HSCs具有收縮或舒張功能，在肝臟的微循環(huán)以及門靜脈高壓的調(diào)節(jié)過程有著非常重要的作用。ET是目前已知的縮血管活性最強(qiáng)的多肽物質(zhì)，參與門靜脈高壓的形成[13]，而ET-1可促進(jìn)HSCs活化、增殖和收縮，是肝硬化進(jìn)程中的重要參與者，故本實(shí)驗(yàn)采用ET-1為DSS含藥血清的調(diào)控對象。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量的DSS含藥血清能夠有效抑制HSCs細(xì)胞肌動蛋白絲數(shù)量增多，同時可以不同程度地抑制ET-1引起的HSCs細(xì)胞膠原凝膠收縮[14]。故本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上考察DSS含藥血清對ET-1誘導(dǎo)的HSCs細(xì)胞收縮的機(jī)制。

ET-1刺激引起的HSCs收縮不依賴鈣通道，其主要由Rho相關(guān)激酶信號途徑介導(dǎo)，在此途徑中RhoA/ROCK通路對HSCs收縮的調(diào)控機(jī)制是近年研究的熱點(diǎn)。Rho蛋白是許多膜表面受體的下游效應(yīng)蛋白，在細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中作為信號轉(zhuǎn)換器或分子開關(guān)，作用于細(xì)胞骨架或其靶蛋白而產(chǎn)生多種生物效應(yīng)，在細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞骨架功能、分泌和細(xì)胞收縮中均發(fā)揮作用[15]，RhoA是其中的一種，它參與調(diào)節(jié)肌動蛋白應(yīng)力纖維的裝配，RhoA相關(guān)激酶ROCKⅠ、ROCK Ⅱ是其下游效應(yīng)分子，接受RhoA傳遞的活化信號[16-17]。如果阻斷RhoA/ROCK信號通路，HSCs的活化、分泌、收縮等均會受到影響。ROCK抑制劑Y-27632是一類人工合成的吡啶類復(fù)合物，通常其以載體介導(dǎo)的方式被細(xì)胞攝取，在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合到Rho蛋白下游效應(yīng)器Rho激酶的催化位點(diǎn)，從而抑制激酶活性[18]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組細(xì)胞內(nèi)RhoA、ROCK Ⅱ蛋白表達(dá)水平較空白組均顯著升高，DSS含藥血清各劑量組較模型組均可不同程度下調(diào)RhoA、ROCKⅡ蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DSS含藥血清可通過抑制RhoA/ROCK通路來抑制HSC-T6細(xì)胞收縮。

eNOS廣泛存在于人體內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肥大細(xì)胞及血細(xì)胞中，通過經(jīng)典eNOS/NO/PKG途徑促進(jìn)平滑肌舒張來維持血管壁穩(wěn)態(tài)[19]。其中NO作為一種強(qiáng)有力的血管內(nèi)皮細(xì)胞舒張因子，具有強(qiáng)烈的擴(kuò)張血管作用，并廣泛參與機(jī)體生理功能的調(diào)節(jié)。肝臟是NO主要合成場所，HSCs表達(dá)eNOS[20]。而eNOS可促進(jìn)NO的合成，從而抑制細(xì)胞收縮產(chǎn)生舒張血管效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，激活的RhoA和ROCKⅡ可通過降低eNOS mRNA穩(wěn)定性、抑制eNOS基因轉(zhuǎn)錄而降低eNOS水平[21]。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組細(xì)胞內(nèi)eNOS蛋白表達(dá)水平較空白組均顯著降低，DSS含藥血清各劑量組與模型組相比均可上調(diào)eNOS蛋白表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)結(jié)果相一致，提示在細(xì)胞層面，eNOS的表達(dá)可調(diào)控HSC-T6細(xì)胞的收縮，DSS可能通過增加eNOS的表達(dá)，升高NO的含量達(dá)到抑制細(xì)胞收縮的作用。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，DSS含藥血清各劑量組對HSCs具有不同程度的影響，DSS作為一種可能的降低門靜脈高壓延緩肝纖維化的藥物，其對于細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)HSCs收縮的鈣離子通道是否存在調(diào)節(jié)，對α-平滑肌肌動蛋白是否存在影響，及其對其他細(xì)胞因子的作用，還有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，DSS含藥血清可能通過下調(diào)RhoA、ROCKⅡ蛋白的表達(dá)，上調(diào)eNOS蛋白的表達(dá)，從而降低肝內(nèi)血管阻力以及門靜脈壓力，起到對ET-1介導(dǎo)的HSCs收縮的保護(hù)作用。

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