★ 吳燕紅 許妍 付輝政 鐘瑞建

(江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院/江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心 南昌 330029)

抗宮炎軟膠囊由廣東紫珠干浸膏、烏藥干浸膏、益母草干浸膏三味藥組成，具有清濕熱，止帶下的功效。用于因慢性宮頸炎引起的濕熱下注，赤白帶下，宮頸糜爛，出血等癥，有較好的臨床療效。全國(guó)有生產(chǎn)企業(yè)2家，但2家企業(yè)的工藝中所用基質(zhì)完全不同，一家用水溶性基質(zhì)聚乙二醇400和聚乙二醇4000，一家用脂溶性基質(zhì)大豆油。方中廣東紫珠干浸膏為君藥，具收斂止血，散瘀，清熱解毒的功效，主要化學(xué)成分為黃酮、苯乙醇苷類、三萜類等，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)[1]，廣東紫珠具有止血、鎮(zhèn)痛、抑菌、抗炎的作用[2]，其主要藥效成分為苯乙醇苷類化合物，2015年版中國(guó)藥典抗宮炎片含量測(cè)定項(xiàng)下即為測(cè)定廣東紫珠中苯乙醇苷類成分連翹酯苷B和金石蠶苷的含量，因抗宮炎軟膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)君藥廣東紫珠干浸膏的含量控制項(xiàng)，難以保證臨床療效與穩(wěn)定，故本研究建立了用同一方法測(cè)定兩種不同性質(zhì)的基質(zhì)制備的抗宮炎軟膠囊中連翹酯苷B和金石蠶苷的含量方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SHIMADZU LC20AD四元低壓梯度泵系列，LC solution化學(xué)工作站，PDA檢測(cè)器；Sartorius CP225D電子天平。

1.2 試藥 對(duì)照品連翹酯苷B(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):111811-201002);金石蠶苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):111812-201303)?？箤m炎軟膠囊(深圳市佳泰藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)150124、150322、150716；貴州匯正制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)150401、150404、150802、150901、151102)。乙腈為色譜純(百靈威公司)；水為Milli-Q制備的超純水；其余試劑為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取連翹酯苷B對(duì)照品10.84mg，置50mL量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為連翹酯苷B對(duì)照品母液。精密稱取金石蠶苷對(duì)照品10.32mg，置50mL量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為金石蠶苷對(duì)照品母液。分別精密量取上述對(duì)照品母液3mL同置25mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，混勻，取約0.5g，精密稱定，置平底燒瓶中，精密加入50%甲醇50mL，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液 除廣東紫珠干浸膏以外，其余藥味按抗宮炎軟膠囊處方量制成缺廣東紫珠干浸膏的陰性對(duì)照溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱：ThermoHypersil C18；流動(dòng)相：以乙腈-0.2%磷酸溶液(14∶86)為流動(dòng)相；流速：0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：332nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。在上述色譜條件下，樣品中連翹酯苷B和金石蠶苷與其他組分的色譜峰分離度良好。色譜圖見圖1。

3 方法學(xué)考察

3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、2、4、8、10μL，連翹酯苷B和金石蠶苷對(duì)照品母液各2、5、10μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果連翹酯苷B回歸方程為Y= 1433329.1298X-5573.5482，r= 0.9999，金石蠶苷回歸方程為Y=1387854.1119X-5647.8574，r=0.9999，連翹酯苷B在0.02443～2.03575μg之間、金石蠶苷在0.02400～2.00002μg呈良好線性關(guān)系。

3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，依次測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果連翹酯苷B和金石蠶苷峰面積的RSD(n=6)分別為1.3%和1.2%，表明儀器精密度良好。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，在12 h內(nèi)于0、1、2、4、8、12h分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果連翹酯苷B和金石蠶苷峰面積的RSD(n=6)分別為0.30%、0.33%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批抗宮炎軟膠囊(深圳市佳泰藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：150716))6份，每份約0.5g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得連翹酯苷B和金石蠶苷平均含量(n=6)分別為2.9924和2.7002 mg/g，RSD分別為1.8%、1.6%。

3.5 回收率試驗(yàn) 精密稱取“3.4”項(xiàng)下已知含量的抗宮炎軟膠囊內(nèi)容物6份，每份約0.25g，精密稱定，分別精密加入混合對(duì)照品溶液(連翹酯苷B對(duì)照品：0.01638 mg/mL ，金石蠶苷對(duì)照品：0.01415 mg/mL)50mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果連翹酯苷B和金石蠶苷的平均回收率(n=6)分別為103.3%和96.2%，RSD分別為1.5%和0.4%。

3.6 耐用性試驗(yàn) 取同一批抗宮炎軟膠囊內(nèi)容物約0.5g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別采用Thermo Hypersil C18(250 mm× 4.6 mm,5 μm)、YMC-Pack ODS-A(250 mm×4.6 mm,5 μm)、InertSustain C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)3種品牌的色譜柱，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果無(wú)明顯差別，RSD值為1.3%。

4 樣品含量測(cè)定

分別取收集到的8批抗宮炎軟膠囊樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算出連翹酯苷B和金石蠶苷的含量，結(jié)果見表1。

1.連翹酯苷B；2金石蠶苷；A.混合對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對(duì)照溶液

表1 抗宮炎軟膠囊中連翹酯苷B和金石蠶苷含量 mg/mL

5 討論

5.1 提取方式的考察 因抗宮炎軟膠囊制法中兩家企業(yè)分別使用了水溶性基質(zhì)聚乙二醇4000、聚乙二醇400和脂溶性基質(zhì)大豆油，故首先考察基質(zhì)對(duì)兩個(gè)組分提取效果是否存在干擾。試驗(yàn)選用了甲醇、50%甲醇和稀乙醇，加熱回流1h，結(jié)果基質(zhì)在三種提取溶劑中均能很好地溶散，連翹酯苷B和金石蠶苷的含量以50%甲醇提取最高，故確定提取溶劑為50%甲醇。進(jìn)而固定50%甲醇為溶劑比較了超聲40min、加熱回流1h對(duì)兩個(gè)組分含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲的方法深圳佳泰藥業(yè)股份有限公司樣品提取液有少量油狀物漂浮，而回流的樣品基質(zhì)溶解性較佳，故確定提取方法為加熱回流。試驗(yàn)還對(duì)加熱回流的時(shí)間進(jìn)行了考察，比較了回流30min、1h、1.5h，結(jié)果表明兩種基質(zhì)的樣品在回流1h和1.5h后，連翹酯苷B和金石蠶苷的含量均無(wú)明顯差異，最終確定本品的提取方法為50%甲醇加熱回流1h。

5.2 規(guī)格制定 根據(jù)表1測(cè)定結(jié)果，參考中國(guó)藥典2015年版抗宮炎膠囊的限度，考慮到軟膠囊制備工藝與硬膠囊的差異以及使用基質(zhì)的影響，按照硬膠囊限度的70%擬定規(guī)格(1)(每粒裝0.75g，深圳佳泰藥業(yè)股份有限公司)限度為：每粒含廣東紫珠干浸膏以連翹酯苷B(C34H44O19)計(jì)，不得少于1.7mg；以金石蠶苷(C35H46O19)計(jì)，不得少于0.8mg。規(guī)格(2)(每粒裝0.65g，貴州光正制藥有限責(zé)任公司)限度為：每粒含廣東紫珠干浸膏以連翹酯苷B(C34H44O19)計(jì)，不得少于2.1mg；以金石蠶苷(C35H46O19)計(jì)，不得少于1.0mg。參照此限度，8批樣品中貴州光正制藥有限責(zé)任公司5批樣品連翹酯苷B均低于限度值，因此為保證臨床用藥的有效性和可控性，有必要對(duì)抗宮炎軟膠囊中有效成分連翹酯苷B和金石蠶苷的含量進(jìn)行控制。

[1]聶韡,朱培林,黃麗莉,等.廣東紫珠藥材的研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥,2011,13(9):37-39+44.

[2]蔡灝,孫秀漫, 歐陽(yáng)彩君,等.HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地廣東紫珠中3種苯乙醇苷的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(10):63-65.