張艷芳 謝豐華 熊 怡 黃 湘

南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛(ài)醫(yī)院，廣東中山 528400

耳聾是指聽覺(jué)系統(tǒng)中各傳導(dǎo)通路及神經(jīng)功能發(fā)生病變所引起的聽力功能障礙，發(fā)生后會(huì)對(duì)患者的工作、學(xué)習(xí)和生活產(chǎn)生明顯影響[1]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示我國(guó)新生兒耳聾的發(fā)病率約為0.8%～1.0%，其中約有80%的患兒除耳聾癥狀外不伴有其他臨床癥狀，我國(guó)臨床將該類型耳聾稱為非綜合征型聾[2]。近年來(lái)，新生兒非綜合征型聾的診斷及防治是我國(guó)臨床的研究熱點(diǎn)[3]。伴隨著基因檢驗(yàn)技術(shù)和分子遺傳學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，現(xiàn)階段已有臨床研究證實(shí)基因突變是引起非綜合征型聾的主要遺傳因素，常見(jiàn)的致聾基因包括GJB2、GJB3、線粒體12SrRNA、SLC26A4[4-5]?；谏鲜鲅芯炕A(chǔ)，本研究對(duì)非綜合征型聾患者常見(jiàn)耳聾基因突變狀況進(jìn)行深入探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究選取2016年1～12月期間在我院分娩的3702例新生兒作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）孕周38～41周足月分娩；（2）出生時(shí)體重≥2500g；（3）出生后3min新生兒Apgar評(píng)分＞8分。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）多胎妊娠；（2）早產(chǎn)、低體重；（3）家屬拒絕參與本次研究。3702例新生兒中，男1836例，女1866例，參與研究時(shí)日齡4～25d，平均（17.43±3.99）d。本次研究在獲取倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的前提下開展，患兒家屬均簽署研究知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取及引物設(shè)計(jì) 采集新生兒臍帶血2～3mL（EDTA抗凝），應(yīng)用廈門致善生物有限公司DNA提取試劑盒提取DNA，取適量樣本稀釋至濃度為100～200ng/μL，剩余標(biāo)本保存在-80℃的環(huán)境中等待檢測(cè)。使用北京博奧晶芯九項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒（微陣列芯片法）進(jìn)行芯片檢測(cè)。本研究共檢測(cè)9個(gè)位點(diǎn)，包括GJB2基因位點(diǎn)（35 del G）、GJB2基因位點(diǎn)（176 del 16）、GJB2基因位點(diǎn)（235 del C）、GJB2基因位點(diǎn)（299 del AT）、GJB3基因位點(diǎn)（538 C＞T）、SLC26A4基因位點(diǎn)（2168 A＞G）、SLC26A4基因位點(diǎn)（IVS7-2 A＞G）、線粒體12S rRNA基因位點(diǎn)（1555A＞G）、線粒體12S rRNA基因位點(diǎn)（1494 C＞T），對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)） PCR反應(yīng)體系容積為20μL，PCR擴(kuò)增條件，溫度37℃，時(shí)間600s，溫度 95℃，時(shí)間 900s，溫度 96℃，時(shí)間 60s，以上各一個(gè)循環(huán)；溫度94℃，時(shí)間30s，溫度55℃，時(shí)間30s，溫度70℃，時(shí)間45s，共32個(gè)循環(huán)；溫度60℃，時(shí)間600s，一個(gè)循環(huán)。得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，然后使用晶芯微陣列芯片掃描儀（LuxScanTM 10K-B）和相應(yīng)的遺傳性耳聾基因檢測(cè)芯片判別系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)讀取及判斷。使用毛細(xì)管電泳法進(jìn)行測(cè)序，與NCBI（美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心）和HGMD（人基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)）提供的基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行對(duì)比分析，篩查出患兒突變的基因位點(diǎn)及突變方式。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究基于SPSS22.0版本統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件建立數(shù)據(jù)分析模型，計(jì)數(shù)型指標(biāo)以百分?jǐn)?shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3702例新生兒非綜合征型聾篩查結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

篩查結(jié)果顯示，3702例新生兒中，共152例新生兒的非綜合征型聾篩查結(jié)果為陽(yáng)性，所占比例為4.11%（152/3702），其中94例攜帶GJB2基因，攜帶率為2.5%，5例攜帶GJB3基因，攜帶率為0.13%，43例攜帶SLC26A4基因，攜帶率為1.16%，10例攜帶線粒體12S rRNA基因，攜帶率為0.27%。

2.2 非綜合征型聾患兒常見(jiàn)耳聾基因突變檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

檢測(cè)結(jié)果顯示152例患兒的主要突變基因?yàn)镚JB2基因和SLC26A4基因，其中GJB2基因突變患兒所占比例為61.84%，與其他基因突變患兒所占比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。各基因的突變位點(diǎn)及突變方式見(jiàn)表2。

表1 152例非綜合征型聾患兒突變基因類型及比例統(tǒng)計(jì)

表2 152例非綜合征型聾患兒的突變位點(diǎn)、突變方式統(tǒng)計(jì)分析[n（%）]

3 討論

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外大量實(shí)踐研究表明，GJB2基因、GJB3基因、線粒體12S rRNA基因、SLC26A4基因是非綜合征型聾的主要致聾基因[6-7]。此外，國(guó)內(nèi)研究學(xué)者開展的一項(xiàng)調(diào)查研究也發(fā)現(xiàn)，耳聾人群GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因，線粒體12S rRNA基因的攜帶率分別為60.46%、3.55%、28.47%和6.49%[8]。上述研究結(jié)果均提示我國(guó)臨床可從基因方向探討非綜合征型聾臨床診斷和防治方法。新生兒為特殊群體，近年來(lái)的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，新生兒非綜合征型聾的發(fā)病率也處于居高不下的狀態(tài)。為促進(jìn)新生兒非綜合征型聾臨床診治工作的順利開展，本研究對(duì)非綜合征型聾患者常見(jiàn)耳聾基因突變狀況進(jìn)行深入分析。

本研究結(jié)果顯示3702例新生兒中，152例患兒存在檢測(cè)基因位點(diǎn)突變，GJB2基因的主要突變位點(diǎn)為235 del C，主要突變形式為雜合突變，發(fā)現(xiàn)GJB2 235 del C純合突變1例，經(jīng)過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)復(fù)合雜合突變7例，其中GJB2 235 del C雜合突變復(fù)合GJB2 608 T＞C雜合突變1例，GJB2 235 del C雜合突變復(fù)合GJB2 109 G＞A雜合突變1例，GJB2 235 del C雜合突變復(fù)合GJB2 341 A＞G、GJB2 79 G＞A雜合突變2例，GJB2 235 del C雜合突變復(fù)合GJB2 299_300 del AT雜合突變1例，GJB2 235 del C 雜合突變復(fù)合GJB2 35 del G 雜合突變1例，GJB2 299_300 del AT雜合突變復(fù)合GJB2 608 T＞C雜合突變1例；SLC26A4基因的主要突變位點(diǎn)為IVS 7-2 A＞G，主要突變形式為雜合突變，經(jīng)過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)復(fù)合雜合突變2例，其中SLC26A4 919-2 A＞G 雜合突變復(fù)合SLC26A4 2168 A＞G 雜合突變1例，SLC26A4 2168 A＞G 雜合突變復(fù)合SLC26A4 426 A＞T 雜合突變1例；線粒體12S rRNA基因的主要突變形式為均質(zhì)突變，發(fā)現(xiàn)線粒體12S rRNA 1555 A＞G 均質(zhì)突變型5例，線粒體12S rRNA 1494 C＞T均質(zhì)突變型4例，線粒體12S rRNA 1555 A＞G異質(zhì)突變型1例。GJB2基因是最常見(jiàn)的耳聾致病基因，遺傳方式表現(xiàn)為隱性遺傳，由該基因?qū)е碌亩@多為重度耳聾，治療難度大[9]。SLC26A（4PDS）基因的遺傳方式表現(xiàn)為隱性遺傳，該基因突變會(huì)導(dǎo)致大前庭水管綜合征，先天或后天中重度以上感音神經(jīng)性耳聾。GJB3基因是我國(guó)本土上克隆的第一個(gè)遺傳致病基因，遺傳方式表現(xiàn)為常染色體顯性和隱性遺傳，該基因突變與后天高頻感音神經(jīng)性耳聾有關(guān)[10]。線粒體12S rRNA基因的遺傳方式表現(xiàn)為母系遺傳，該基因突變會(huì)導(dǎo)致藥物性耳聾，目前一部分研究學(xué)者推測(cè)線粒體12S rRNA基因調(diào)控區(qū)可能存在不致聾的突變位點(diǎn)，但通過(guò)現(xiàn)有的篩查方法尚未發(fā)現(xiàn)。馬建鸝等[11]臨床研究對(duì)陜西省800例非綜合征型聾患者常見(jiàn)致聾基因突變狀況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示800例非綜合征型聾患者中，44.13%患者攜帶耳聾致病基因，其中GJB2基因突變患者所占比例最大，其次為線粒體12S rRNA基因，GJB2基因的突變位點(diǎn)主要為235 del C，SLC26A4基因的主要突變位點(diǎn)為IVS 7-2 A＞G。我院本次研究所得上述研究結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)果基本保持一致[12-16]。

綜上所述，本研究認(rèn)為新生兒非綜合征型聾的主要基因突變?yōu)镚JB2基因突變和SLC26A4基因突變，通過(guò)耳聾基因篩查有利于明確新生兒非綜合征型聾的發(fā)病分子學(xué)基礎(chǔ)，可為臨床大規(guī)模篩查和輔助診斷新生兒非綜合征型聾提供參考依據(jù)，在降低我國(guó)殘障兒童發(fā)生率中發(fā)揮著重要作用。

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