張春霆，周國宏，盧 蓉，孔 麗

（1浙江大學(xué)金華醫(yī)院，金華市中心醫(yī)院泌尿外科，浙江 金華321000；2山西省眼科醫(yī)院，山西 太原 030002；3浙江省金華市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江 金華321000；4山西醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室，山西太原030001）

0 引言

腫瘤發(fā)生發(fā)展有多種途徑，例如干細(xì)胞演化、自噬消失、信號(hào)通路異常、DNA損傷修復(fù)異常［1-4］，多個(gè)基因突變及異常表達(dá)可能參與了腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展，前列腺癌與其他腫瘤一樣，也可能有多種因素參與，研究［5-8］顯示Claudins可能參與多種腫瘤的發(fā)生，也有報(bào)道［9-10］其家族成員與前列腺癌的關(guān)系。本研究利用SP法對(duì)Claudin-1在前列腺癌中的表達(dá)進(jìn)行檢測，探討其與前列腺癌的臨床特征及病理之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 一般資料 取浙江大學(xué)金華醫(yī)院和山西醫(yī)科大學(xué)2010～2015年病理組織庫前列腺癌組織標(biāo)本72 例，年齡 51～79 歲，中位年齡（68．5±5．5）歲。 前列腺癌分為Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期33例。Gleason評(píng)分＜7分的38例，Gleason評(píng)分≥7分的34例。前列腺增生組織42例，年齡52～82歲，中位年齡（69．5±6．5）歲。兩組一般狀況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有患者術(shù)前均未接受放化療和內(nèi)分泌治療，所有標(biāo)本10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后3 μm連續(xù)切片。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法 構(gòu)建8×8點(diǎn)陣的組織芯片2個(gè)，一個(gè)免疫組化染色，一個(gè)陰性對(duì)照。對(duì)標(biāo)記的組織利用點(diǎn)陣儀打點(diǎn)取樣在多聚賴氨酸載玻片上。每例前列腺癌標(biāo)本和前列腺增生標(biāo)本均取1個(gè)點(diǎn)，6 h烤片，芯片制作完成。應(yīng)用SP法進(jìn)行兔抗人Claudin-1蛋白單克隆抗體免疫組化染色。各步驟間均以0．1%PBS洗5 min×3次，后DAB顯色（SP試劑盒和 DAB顯色劑均為北京中杉生物技術(shù)公司產(chǎn)品），脫水透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1．3 結(jié)果判定 Claudin-1染色主要是細(xì)胞膜出現(xiàn)棕紅色顆粒為陽性染色，根據(jù)陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)決定表達(dá)陽性。陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)＜10%為（-），陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù) 10%～25%為（+），陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)＞50%為（++），陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)＞75%為（+++）。陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)（++）以上為陽性。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 前列腺癌染色結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS20．0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)兩樣本陽性率比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或Fisher概率法，p＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 Claudin-1在前列腺癌中的表達(dá)位置 免疫組化染色結(jié)果Claudin-1主要表達(dá)于細(xì)胞膜上。Claudin-1在前列腺癌中表達(dá)明顯高于前列腺增生；前列腺增生陽性表達(dá)率33．33%（14／42），前列腺癌 Claudin-1 陽性表達(dá)率為 63．89%（46／72）（p＜0．05，表 1）。

A：Claudin-1在前列腺增生中的表達(dá)（×400）；B：Claudin-1在前列腺癌中的表達(dá)（×400）

表1 Claudin-1在前列腺癌和前列腺增生中的表達(dá)

2．2 Claudin-1與前列腺癌Gleason評(píng)分和臨床分期之間的關(guān)系 Claudin-1在34例前列腺癌≥7分的陽性表達(dá)率為 76．47%（26／34），38 例前列腺癌＜7 分的陽性表達(dá)率為 52．63%（20／38），兩者之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0．05）。 Claudin-1在前列腺癌Ⅰ～Ⅱ期陽性表達(dá)率為52．63%（20／38），Ⅲ～Ⅳ期陽性表達(dá)率為 76．47%（26／34），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0．05，表 1）。

3 討論

前列腺癌發(fā)病率在我國呈現(xiàn)上升趨勢［11］。一段時(shí)間內(nèi)，由于我國對(duì)前列腺癌篩查率低，部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期。前列腺癌與多種基因相關(guān)。我們前期發(fā)現(xiàn)緊密連接蛋白參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，它的異常導(dǎo)致上皮屏障遭到破壞，細(xì)胞間粘附力下降［12-13］。Claudin-1基因是其家族成員之一，其翻譯的蛋白是構(gòu)成緊密連接的必需成分，參與維持細(xì)胞的極性和細(xì)胞間屏障功能，并且在細(xì)胞間的傳輸轉(zhuǎn)運(yùn)及信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用［14-15］。

Claudins蛋白表達(dá)有組織相關(guān)性，不同組織中Claudins蛋白表達(dá)不同，即使是同一組織表達(dá)的Claudins蛋白也有較大區(qū)別，目前認(rèn)為Claudins蛋白表達(dá)異常與細(xì)胞間粘附性丟失的機(jī)制及腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。然而，在一些腫瘤組織中，Claudin-1表達(dá)較正常組織下降，這也意味著Claudin-1表達(dá)下降可能也在腫瘤的發(fā)生中起參與作用。本研究采用組織芯片及免疫組化技術(shù)對(duì)前列腺癌和前列腺增生中Claudin-1表達(dá)狀況進(jìn)行了分析，檢測結(jié)果顯示，Claudin-1主要表達(dá)在細(xì)胞膜上，在胞質(zhì)及胞核中表達(dá)不明顯。Claudin-1在前列腺癌中呈高表達(dá)；前列腺癌和前列腺增生中 Claudin-1陽性表達(dá)率分別為63．89%（46／72）和 33．33%（14／42）。 Claudin-1 表達(dá)在 Gleason評(píng)分＜7 分的陽性表達(dá)率為 52．63%（20／38），在Gleason評(píng)分≥7 分的表達(dá)率為 76．47%（26／34），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0．05）。在前列腺癌臨床Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期陽性表達(dá)率分別為52．63%（20／38）和79．41%（26／34），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0．05）。 說明其表達(dá)與前列腺癌的臨床分期及Gleason評(píng)分有關(guān)，可能參與前列腺癌進(jìn)展，至于它在前列腺癌進(jìn)展中如何作用有待進(jìn)一步研究。雖然本研究也發(fā)現(xiàn)Claudin-1與前列腺癌臨床病理和臨床分期相關(guān)，但是確切的發(fā)病機(jī)制并沒有明確。

國內(nèi)有利用組織芯片技術(shù)及免疫組化方法檢測Claudin-1和Claudin-3蛋白在食管癌組織和癌旁黏膜中的表達(dá)，探討Claudin-1和Claudin-3蛋白在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Claudin-1和Claudin-3蛋白陽性表達(dá)主要見于食管癌細(xì)胞膜，其次表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，在食管鱗癌組織和癌旁組織中Claudin-1及Claudin-3的表達(dá)率分別為 76．4%和 38．3%與24．6%和79．2%，食管鱗癌的發(fā)生可能與Claudin-1的表達(dá)上調(diào)及Claudin-3的表達(dá)下調(diào)有關(guān)［16］。也有對(duì)結(jié)腸癌中Claudin-1表達(dá)狀況進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，隨著腫瘤的病理進(jìn)展，Claudin-1表達(dá)增高，推測其作用機(jī)制是通過增高表達(dá)的使E-鈣黏蛋白表達(dá)減少，引起β-catenin在細(xì)胞內(nèi)聚集，致使 β-catenin／Tef信號(hào)通路上調(diào)，促進(jìn)Claudin-1高表達(dá)，還可導(dǎo)致金屬基質(zhì)蛋白酶-2活性增強(qiáng)，促進(jìn)Claudin-4高表達(dá)。兩者共同作用引起緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)和功能破壞，導(dǎo)致組織黏附力下降或黏附分子破壞。腫瘤細(xì)胞易脫離原發(fā)灶，黏附于周圍間質(zhì)或正常細(xì)胞基膜、血管、淋巴管。腫瘤細(xì)胞遷涉力、侵襲力增加促進(jìn)腫瘤浸潤，最終導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［17］。本研究不僅對(duì)Claudin-1在前列腺癌中定位進(jìn)行了觀察，并對(duì)Claudin-1在前列腺癌臨床分期及分級(jí)特征進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果顯示Claudin-1異常表達(dá)可能參與了前列腺癌的發(fā)生進(jìn)展。雖然實(shí)驗(yàn)中Claudin-1在前列腺癌中表達(dá)不具有特異性，例如在乳腺癌中，Claudin-1卻是丟失的，這種情況被認(rèn)為細(xì)胞的極性丟失和細(xì)胞間生長因子失衡會(huì)以自分泌或旁分泌形式刺激上皮細(xì)胞發(fā)生乳腺腫瘤［18］。在宮頸癌中，Claudin-1表達(dá)是上升的，可能由于宮頸癌與HPV直接相關(guān)，HPV刺激Claudin-1改變有關(guān)。本研究對(duì)Claudin-1在前列腺癌中的作用機(jī)制雖未闡明，但早期聯(lián)合檢測也可能對(duì)前列腺癌的早期診斷有參考價(jià)值，并對(duì)預(yù)后評(píng)估有重要意義。

本研究將免疫組化和組織芯片技術(shù)相結(jié)合，對(duì)前列腺癌中Claudin-1蛋白進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。研究結(jié)果證實(shí)Claudin-1與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但因?yàn)镃laudin-1功能復(fù)雜多樣，其在前列腺癌中的作用尚需更進(jìn)一步研究證實(shí)。

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