柯 鴻，牛曉娟，潘龍瑞，潘 興

1. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院 血液內(nèi)科(十堰 442000)；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院 生物科學(xué)系(十堰 442000)； 3.湖北醫(yī)藥學(xué)院 藥理學(xué)教研室(十堰 442000)；4.十堰市太和醫(yī)院感染與免疫性疾病研究所(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)(十堰 442000)

幽門(mén)螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)在全球范圍內(nèi)的感染率已超過(guò)50%，在我國(guó)的感染率為42%～90%，現(xiàn)已確定為慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等消化道疾病的主要致病菌，1994 年被世界衛(wèi)生組織列為Ⅰ類(lèi)致癌因子[1-2]。

抗原表位，又稱(chēng)抗原決定簇或抗原決定基(antigenic determinant，AD)，決定了抗原分子的特異性。H.pylori感染可刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)，但卻不能使其清除，原因在于機(jī)體對(duì)H.pylori自身天然抗原產(chǎn)生了免疫耐受，選擇H.pylori保護(hù)性抗原的優(yōu)勢(shì)表位來(lái)構(gòu)建表位疫苗，有可能打破機(jī)體的免疫耐受，從而達(dá)到免疫預(yù)防和清除H.pylori感染的目的[3]。

本研究根據(jù)文獻(xiàn)查找、篩選出了幽門(mén)螺桿菌相關(guān)抗原的12個(gè)顯性表位序列，分別為HpaA88-100、HpaA132-141、UreA27-53、UreA183-203、UreB229-251、UreB317-329、UreB321-339、UreB373-385、UreB438-452、UreB546-561、CagA149-164、CagA196-217[4]。通過(guò)Linker將其串聯(lián)，在其N(xiāo)端引入分子內(nèi)佐劑CTB序列，即為口服幽門(mén)螺桿菌多價(jià)表位疫苗CTB-HUUC，并初步探究了其對(duì)BABL/c小鼠的免疫治療效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠及菌株 SPF級(jí)BABL/c小鼠，雌性，5～6周齡，體質(zhì)量14～18 g。H.pyloriSS1為本實(shí)驗(yàn)室傳代保種。

1.1.2 儀器與主要實(shí)驗(yàn)試劑 AKTA pure 25蛋白純化儀、Ni Sepharose HP層析填料、GSTrap HP層析柱購(gòu)自GE公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN；蛋白胨、酵母抽提物購(gòu)自O(shè)XOID公司；其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組ctB-HUUC基因設(shè)計(jì)與合成 通過(guò)Linker序列(KK)將以下表位進(jìn)行串聯(lián)：HpaA88-100、HpaA132-141、UreA27-53、UreA183-203、UreB229-251、UreB317-329、UreB321-339、UreB373-385、UreB438-452、UreB546-561、CagA149-164、CagA196-217，并通過(guò)Linker序列(GSGS)在其N(xiāo)端引入分子內(nèi)佐劑CTB序列，見(jiàn)圖1。密碼子優(yōu)化后，由上海生工進(jìn)行基因合成。ctB-HUUC基因序列如下。

圖1 口服幽門(mén)螺桿菌多價(jià)表位疫苗CTB-HUUC的設(shè)計(jì)示意圖

1.2.2 重組質(zhì)粒pET28a(+)/ctB-HUUC構(gòu)建 將ctB-HUUC基因通過(guò)NcoⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)與pET28a(+)載體相連，酶切、測(cè)序鑒定。

1.2.3 重組蛋白CTB-HUUC的誘導(dǎo)、表達(dá)及純化

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET28a(+)/ctB-HUUC轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)。挑取單克隆至100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。第二天以1∶100接種至2 000 mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600約0.6，加入IPTG至終濃度為0.5 mM，誘導(dǎo)18 h。12 000 rpm離心30 min收集菌體；超聲裂解液重懸菌體，超聲60 min；18 000 rpm離心45 min，收集上清；0.22 μm過(guò)濾，備用。采用Ni Sepharose HP層析填料純化，純化結(jié)合緩沖液為25 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、30 mM咪唑，pH7.4；洗脫緩沖液為25 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、500 mM咪唑，pH7.4。

1.2.4 Western Blot 蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離，濃縮膠電壓80 V、15 min；分離膠120 V、50 min。之后采用半干轉(zhuǎn)法進(jìn)行Western Blot轉(zhuǎn)膜，調(diào)整電壓至24 V、恒壓轉(zhuǎn)PVDF膜1 h。5%脫脂奶粉室溫封閉30 min，TBST洗滌3次，5 min/次。添加兔抗幽門(mén)螺桿菌抗體(1∶1 000稀釋)(ThermoFisher Scientific，美國(guó))或者鼠抗CTB單抗(1∶5 000稀釋)(Abcam，美國(guó))，室溫孵育2 h，TBST洗滌4次，5 min/次。添加HRP-羊抗鼠IgG(1∶10 000稀釋)(Sigma，美國(guó))或者HRP-羊抗兔IgG(1∶10 000稀釋)(Sigma，美國(guó))，室溫孵育1 h，TBST洗滌4次，5 min/次。采用Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore，美國(guó))試劑進(jìn)行顯影，Carestream 醫(yī)用X光洗片機(jī)進(jìn)行洗片。

1.2.5 GM1-ELISA 采用神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)酶聯(lián)免疫吸附法(GM1-ELISA)測(cè)定重組蛋白CTB-HUUC體外結(jié)合GM1的能力。實(shí)驗(yàn)組酶標(biāo)板包被1 μg/孔GM1，對(duì)照組酶標(biāo)板包被1 μg/孔牛血清白蛋白(BSA)，4 ℃過(guò)夜。采用含有5%BSA 的PBST封閉液37 ℃封閉1 h。每孔加入0、2、4、8、16、32 μg CTB-HUUC；0、2、4、8、16、32 μg CTB或者0、2、4、8、16、32 μg BSA，每孔再加入小鼠抗CTB單抗(1∶5 000稀釋)，37 ℃孵育1 h。HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶10 000稀釋)，37 ℃孵育1 h。加入配制的TMB底物溶液100 μL/孔，37 ℃孵育15 min。各反應(yīng)孔中加入2 M硫酸50 μL，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀450 nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。

1.2.6H.pyloriSS1感染BABL/c 小鼠 SPF級(jí)BABL/c小鼠，雌性，6周齡，隨機(jī)分為3組，每組6只?？诜辔?0 μLH.pyloriSS1，菌落總數(shù)為109CFU，口服1次/d，連續(xù)感染4次。末次感染后4周，CTB-HUUC組和CTB組口服灌胃重組蛋白200 μg/次，每周1次，連續(xù)免疫4次。PBS組口服PBS 100 μL/次，每周1次，連續(xù)灌胃4次。末次免疫后2周，脫頸處死小鼠，取出小鼠胃組織，沿著胃大彎一分為二。將其中1/2胃組織放入2 mL EP管中，組織勻漿器進(jìn)行勻漿，梯度稀釋?zhuān)坎加拈T(mén)螺桿菌選擇性固體平板培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pET28a(+)/ctB-HUUC酶切鑒定

pET28a(+)/ctB-HUUC經(jīng)NcoⅠ、XhoⅠ雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳時(shí)出現(xiàn)一條約1 000 bp的條帶；與ctB-HUUC基因理論大小1 071 bp一致(圖2)。測(cè)序結(jié)果與ctB-HUUC基因理論序列100%一致，重組質(zhì)粒pET28a(+)/ctB-HUUC構(gòu)建正確。

圖2 重組質(zhì)粒pET28a(+)/ctB-HUUC酶切鑒定

注：M:DNA Marker；1:pET28a(+)/ctB-HUUC質(zhì)粒經(jīng)NcoⅠ、XhoⅠ雙酶切

2.2 重組蛋白CTB-HUUC的誘導(dǎo)、表達(dá)及純化

pET28a(+)/ctB-HUUC轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)，誘導(dǎo)后的菌體在40 kDa處出現(xiàn)顯著加粗的蛋白條帶，與理論蛋白大小一致，灰度掃描結(jié)果顯示，其表達(dá)量占菌體總蛋白的28.6%。重組蛋白CTB-HUUC經(jīng)鎳離子層析柱純化后純度為96.3%(圖3)。

圖3 重組蛋白CTB-HUUC的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

注：M:Protern Marker；1:誘導(dǎo)前菌體；2:誘導(dǎo)后菌體；3:純化后CTB-HUUC樣品

2.3 Western Blot鑒定重組蛋白CTB-HUUC

重組CTB蛋白、重組CTB-HUUC蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，分別進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色及Western Blot分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。CTB-HUUC蛋白均可與CTB單抗及抗H.pyloriSS1小鼠血清發(fā)生特異性反應(yīng)。

圖4 Western Blot鑒定重組蛋白CTB-HUUC

注：1:CTB蛋白；2:CTB-HUUC蛋白。一抗：鼠抗CTB單抗1∶5 000稀釋?zhuān)每褂拈T(mén)螺桿菌抗體1∶1 000稀釋?zhuān)欢梗?HRP-羊抗鼠IgG1∶10 000稀釋?zhuān)琀RP-羊抗兔IgG 1∶10 000稀釋

2.4 GM1-ELISA檢測(cè)重組蛋白CTB-HUUC體外結(jié)合GM1的能力

重組CTB蛋白、重組CTB-HUUC蛋白體外均可和GM1結(jié)合，并且在一定濃度范圍內(nèi)，隨著CTB-HUUC濃度升高其結(jié)合GM1的能力加強(qiáng)，呈濃度依賴(lài)關(guān)系，而對(duì)照組BSA蛋白不能結(jié)合GM1(圖5)。說(shuō)明重組蛋白CTB-HUUC具有良好的分子內(nèi)佐劑活性。

圖5 GM1-ELISA檢測(cè)重組蛋白CTB-HUUC的分子內(nèi)佐劑活性

注：實(shí)驗(yàn)組酶標(biāo)板包被1 μg/孔GM1，對(duì)照組酶標(biāo)板包被1 μg/孔牛血清白蛋白(BSA)。CTB-HUUC組、CTB組和BSA組每孔分別加入0、2、4、8、16、32 μg蛋白 。每孔再加入小鼠抗CTB單抗(1∶5 000稀釋)，37 ℃孵育1 h。HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶10 000稀釋)，37 ℃孵育1 h。TMB顯色，測(cè)各孔OD450 nm值

2.5 口服幽門(mén)螺桿菌多價(jià)表位疫苗CTB-HUUC的免疫治療效果

H.pyloriSS1在固體選擇性平板培養(yǎng)3～5 d后，菌落呈圓形、無(wú)色、透明、針尖樣(圖6A)。H.pyloriSS1為革蘭陰性細(xì)菌，呈彎曲、S 形或海鷗形(圖6B)。BABL/c小鼠口服幽門(mén)螺桿菌多價(jià)表位疫苗CTB-HUUC的免疫治療方案見(jiàn)圖6C。末次免疫后2周，小鼠胃組織研磨液在幽門(mén)螺桿菌固體選擇性平板上進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，CTB-HUUC組、CTB組和PBS組分別為：6.14×103、5.72×106、6.70×106CFU/g(圖6D)。

圖6 幽門(mén)螺桿菌多價(jià)表位疫苗CTB-HUUC的免疫治療效果

注： A:H.pyloriSS1在固體選擇性平板培養(yǎng)3 d后菌落形態(tài)；B:H.pyloriSS1革蘭染色，顯微鏡下放大1 000倍觀(guān)察；C:小鼠感染與免疫治療實(shí)驗(yàn)方案； D:末次免疫后2周，小鼠胃組織研磨液在幽門(mén)螺桿菌固體選擇性平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。與CTB-HUUC組比較，***P<0.001；CTB組與PBS組比較，ns(P=0.238)

3 討論

目前H.pylori感染的治療方案為質(zhì)子泵抑制劑、 阿莫西林加上甲硝唑或克拉霉素的“三聯(lián)療法”，但隨著抗生素的大量使用，H.pylori產(chǎn)生了較普遍的耐藥性，且抗生素療法療效不良反應(yīng)較多，菌體清除后機(jī)體易產(chǎn)生二次感染等缺陷，因此，研發(fā)H.pylori疫苗顯得尤為重要[3]。

N-乙酰神經(jīng)氨酰乳糖結(jié)合原纖維血凝素(H.pyloriadhesion A subunit, HpaA)是由H.pylori產(chǎn)生于菌體表面并參與和胃上皮細(xì)胞發(fā)生特異性黏附，以其作為免疫原進(jìn)行疫苗研究得到了極大關(guān)注[5]。

尿素酶分布在H.pylori表面，占全菌體蛋白的5%～10%，它由A、B 2個(gè)亞單位組成，呈六聚體，幾乎所有H.pylori菌株均能產(chǎn)生尿素酶，且尿素酶氨基酸同源性很高。在胃部強(qiáng)酸性環(huán)境中，H.pylori的尿素酶能夠水解尿素釋放氨和水，在菌體周?chē)纬伞鞍痹啤币缘挚刮覆恐械乃嵝原h(huán)境[6]。因此，尿素酶是H.pylori最佳的疫苗候選抗原之一[7]。

細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A (Cytotoxin-associated gene A, CagA)是H.pylori編碼的一種重要毒力因子，由Cag致病島(Cag pathogenicityisland, cag PAI)編碼、經(jīng)Ⅳ型分泌系統(tǒng)(type 4 secretion system，T4SS)分泌并轉(zhuǎn)入胃上皮細(xì)胞內(nèi)，具有致癌作用[8]。東亞國(guó)家人群的H.pylori分離株90%以上可編碼CagA蛋白，在歐美國(guó)家人群中約有60%～70%的H.pylori編碼CagA蛋白，因而，CagA作為H.pylori疫苗的候選抗原也得到了大量研究[9]。

自1983年兩位澳大利亞科學(xué)家Marshall和Warren發(fā)現(xiàn)并分離出H.pylori以來(lái)，H.pylori疫苗的研發(fā)一直廣受關(guān)注[10]。近年來(lái)，H.pylori疫苗的研發(fā)取得了重要進(jìn)展，第三軍醫(yī)大學(xué)與安徽蕪湖康衛(wèi)生物科技有限公司研制出了以尿素酶B亞單位為疫苗抗原，以L(fǎng)TA2B為分子內(nèi)黏膜佐劑的口服幽門(mén)螺桿菌疫苗，Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，在6～15歲兒童體內(nèi)疫苗的保護(hù)率為71.8%[11]。

盡管H.pylori單亞單位疫苗取得了重要突破，多價(jià)疫苗或許會(huì)進(jìn)一步提高疫苗的免疫強(qiáng)度和廣度，進(jìn)而阻止病原體H.pylori的變異性免疫逃避[12]。

本研究選擇HpaA、UreA、UreB及CagA作為口服幽門(mén)螺桿菌多價(jià)疫苗的靶抗原，但考慮到重組蛋白HpaA-UreA-UreB-CagA的分子量過(guò)大及其在誘導(dǎo)表達(dá)、純化過(guò)程中潛在的問(wèn)題，因而，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，分別在靶抗原HpaA中選擇了1個(gè)Th細(xì)胞表位HpaA88-100和1個(gè)B細(xì)胞表位HpaA132-141[13]；在靶抗原UreA中選擇了1個(gè)Th細(xì)胞表位UreA27-53和1個(gè)B細(xì)胞表位UreA183-203[14]；在靶抗原UreB中選擇了5個(gè)Th細(xì)胞表位UreB229-251、UreB317-329、UreB373-385、UreB438-452、UreB546-561和1個(gè)B細(xì)胞表位UreB321-339[15-16]；在靶抗原CagA中選擇了2個(gè)Th細(xì)胞表位CagA149-164和CagA196-217[15]；再通過(guò)Linker序列(KK)將其進(jìn)行串聯(lián)，并通過(guò)Linker序列(GSGS)在其N(xiāo)端引入分子內(nèi)佐劑CTB序列，形成口服幽門(mén)螺桿菌多價(jià)表位疫苗CTB-HUUC(圖1)。

SDS-PAGE檢測(cè)CTB-HUUC蛋白純度為96.3%，可很好滿(mǎn)足小鼠免疫治療要求(圖3)；Western Blot結(jié)果顯示，CTB-HUUC蛋白均可與CTB單抗及抗H.pyloriSS1小鼠血清發(fā)生特異性反應(yīng)(圖4)；GM1 ELISA結(jié)果顯示，重組CTB-HUUC蛋白體外可和GM1結(jié)合，并且在一定濃度范圍內(nèi)，隨著重組蛋白濃度的升高其結(jié)合GM1的能力也隨著加強(qiáng)，呈濃度依賴(lài)關(guān)系，具有良好的分子內(nèi)佐劑活性(圖5)。BABL/c小鼠口服幽門(mén)螺桿菌多價(jià)表位疫苗CTB-HUUC后，其在幽門(mén)螺桿菌選擇性固體平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)為6.14×103(CFU/g)，較CTB組5.72×106(CFU/g)以及PBS組6.70×106(CFU/g)降低(P<0.001)(圖6)。

綜上所述，本研究獲得了純度高達(dá)96.3%的重組CTB-HUUC蛋白，BABL/c小鼠口服CTB-HUUC后體內(nèi)的H.pyloriSS1定值量明顯降低。本研究下一步將深入研究CTB-HUUC刺激BABL/c小鼠所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答類(lèi)型及其免疫保護(hù)機(jī)制。

[1]Eusebi L H, Zagari R M, Bazzoli F. Epidemiology of helicobacter pylori infection[J]. Helicobacter, 2014, 19: 1-5.

[2]Plummer M, Franceschi S, Vignat J,etal. Global burden of gastric cancer attributable toHelicobacterpylori[J]. Int J Cancer, 2014, 136(2): 487-490.

[3]Malfertheiner P, Megraud F, O′Morain C A,etal. Management of Helicobacter pylori infection-the Maastricht V/Florence Consensus Report[J]. Gut, 2017, 66(1): 6-30.

[4]Chen L, Li B, Yang W C,etal. A dominant CD4(+) T-cell response to Helicobacter pylori reduces risk for gastric disease in humans[J]. Gastroenterology, 2013, 144(3): 591-600.

[5]Hu J, Chen L, Yang W,etal. Systematic identification of immunodominant CD4+T cell responses to HpaA in Helicobacter pylori infected individuals[J]. Oncotarget, 2016, 7(34): 54380-54391.

[6]Fong Y H, Wong H C, Yuen M H,etal. Structure of UreG/UreF/UreH complex reveals how urease accessory proteins facilitate maturation of Helicobacter pylori urease[J]. PLoS Biol, 2013, 11(10): e1001678.

[7]Peleteiro B, Bastos A, Ferro A,etal. Prevalence of Helicobacter pylori infection worldwide: a systematic review of studies with national coverage[J]. Dig Dis Sci, 2014, 59(8): 1698-1709.

[8]Hatakeyama M. Helicobacter pylori CagA and gastric cancer: a paradigm for hit-and-run carcinogenesis[J]. Cell Host Microbe, 2014, 15(3): 306-316.

[9]Garza-González E, Perez-Perez G I, Maldonado-Garza H J,etal. A review of Helicobacter pylori diagnosis, treatment, and methods to detect eradication[J]. World J Gastroenterol, 2014, 20(6): 1438-1449.

[10] Graham D Y. Helicobacter pylori update: gastric cancer, reliable therapy, and possible benefits[J]. Gastroenterology, 2015, 148(4): 719-731.

[11] Zeng M, Mao X H, Li J X,etal. Efficacy, safety, and immunogenicity of an oral recombinant Helicobacter pylori vaccine in children in China: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trial[J]. Lancet, 2015, 386(10002): 1457-1464.

[12] Guo L, Yin R, Xu G,etal. Immunologic properties and therapeutic efficacy of a multivalent epitope-based vaccine against four Helicobacter pylori adhesins (urease, Lpp20, HpaA, and CagL) in Mongolian gerbils[J]. Helicobacter, 2017, 22(6): e12428.

[13] Li H B, Zhang J Y, He Y F,etal. Systemic immunization with an epitope-based vaccine elicits a Th1-biased response and provides protection against Helicobacter pylori in mice[J]. Vaccine, 2012, 31(1): 120-126.

[14] Guo L, Yang H, Tang F,etal. Oral Immunization with a Multivalent Epitope-Based Vaccine, Based on NAP, Urease, HSP60, and HpaA, Provides Therapeutic Effect on H. pylori Infection in Mongolian gerbils[J]. Front Cell Infect Microbiol, 2017, 7: 349.

[15] Yang W C, Chen L, Li H B,etal. Identification of two novel immunodominant UreB CD4(+) T cell epitopes in Helicobacter pylori infected subjects[J]. Vaccine, 2013, 31(8): 1204-1209.

[16] Nedrud J G, Bagheri N, Sch?n K,etal. Subcomponent vaccine based on CTA1-DD adjuvant with incorporated UreB class II peptides stimulates protective Helicobacter pylori immunity[J]. PLoS One, 2013, 8(12): e83321.