徐鵬遙，楊 漾，蘇夢翔*，狄 斌**

（中國藥科大學 1江蘇省藥物分子設計與成藥性優(yōu)化重點實驗室；2蛋白質(zhì)化學與結(jié)構(gòu)生物學重點實驗室；3藥物分析系，南京210009）

谷胱甘肽（glutatione）［1］是一種由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結(jié)合且含有巰基的三肽，具有抗氧化及整合解毒的作用。谷胱甘肽不僅作為內(nèi)源性物質(zhì)參與生命活動，在臨床上也有著廣泛應用。主要用于治療重金屬、氟化物等中毒以及輔助治療肝炎、溶血性疾病、白內(nèi)障等疾病，其含量水平與機體健康息息相關［2］。

谷胱甘肽體內(nèi)分析最大的難點在于它的不穩(wěn)定性，其在血漿中能迅速轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽，增加了樣品的測定難度。血漿中谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽的比值是反映機體氧化損傷的重要指標，從20世紀50年代起，研究者就開始建立谷胱甘肽的各種測定方法。目前主要包括熒光光譜法、HPLC法、HPCE法及質(zhì)譜法等［3－7］，其中LC-MS／MS法是現(xiàn)今最常用的測定谷胱甘肽的方法。在已有的文獻報道中［8－10］，對谷胱甘肽進行直接測定的定量限多在50～200 nmol／L之間，靈敏度和選擇性都不能滿足生物體內(nèi)樣本分析的要求。對谷胱甘肽進行衍生化能夠有效保護半胱氨酸中的殘基，避免谷胱甘肽被氧化，使得測定值更加接近實際值。目前利用衍生化法測定谷胱甘肽的定量限多集中在1～100 nmol／L之間［11－13］。但現(xiàn)有的衍生化法存在靈敏度低、前處理復雜、重復性差等問題。隨著對谷胱甘肽研究的不斷深入，如何解決干擾、快速并準確的測定復雜樣品中谷胱甘肽的含量成了研究熱點之一。

本研究將新型季銨衍生化試劑4-（N-馬來酰亞胺）苯基三甲基碘化銨（MPTA）應用于谷胱甘肽在大鼠血漿中的測定，并進行方法學驗證。極大地提高了對谷胱甘肽測定的靈敏度，最終定量下限可達到10 pmol／L左右。目前尚未有文獻對大鼠血漿中內(nèi)源性谷胱甘肽的測定進行報道。少量文獻對測定人體血漿中谷胱甘肽的含量進行了報道［14－16］，由于谷胱甘肽的不穩(wěn)定性及分析方法的不同，使得這些研究的測定結(jié)果存在著很大差異。此外，在內(nèi)源性谷胱甘肽的測定中，大量含巰基的內(nèi)源性蛋白會對樣品的衍生化產(chǎn)生較大的干擾，也會使測定結(jié)果存在差異。因此本方法對生物體內(nèi)谷胱甘肽準確的定量、定性分析，以及其存在狀態(tài)的正確評價有著重要的臨床意義。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

乙腈（色譜純，美國默克公司）；甲酸（色譜純，美國天地公司）；MPTA（自制，純度大于98%）；甘氨酰酪氨酸內(nèi)標（上海阿拉丁生化科技有限公司，純度大于98%），L-還原型谷胱甘肽（GSH，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度大于98%）水淡超純水。

1.2 儀 器

Shimadzu 2010高效液相色譜儀（日本島津公司），含在線真空脫氣機、四元梯度泵、恒溫自動進樣器、柱溫箱；Thermo TSQ質(zhì)譜儀（美國賽默飛世爾公司），含電噴霧離子源ESI、Xcalibur數(shù)據(jù)工作站；BS 21 S十萬分之一分析天平（德國賽多利斯公司）；XHF-1高速分散器（上海金達生化儀器廠）；PL5242純化水制備系統(tǒng)（美國頗爾公司）；D3415R低溫高速離心機（美國BioTool公司）。

1.3 動 物

雄性SPF級SD大鼠，體重（200±20）g，由上海杰思捷實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（滬）2013-0006。

2 方 法

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax HILIC PLUS色譜柱（4.6 mm×100 mm，3.5μm）；預柱：菲羅門 C4（4.0 mm×2.0 mm）；流動相：乙腈-水（含 0.1%甲酸）（75∶25）；流速：1 mL／min；柱溫：35℃。內(nèi)標：甘氨酰酪氨酸。

2.2 質(zhì)譜條件

離子化方式：ESI；掃描方式：選擇反應監(jiān)測（SRM）；離子極性：正離子；檢測：谷胱甘肽原型監(jiān)測離子為m／z308.06→179.00（M＋H）＋，碰撞電壓為25 eV。谷胱甘肽衍生化產(chǎn)物監(jiān)測離子為m／z538.20→265.02（M＋H）＋，碰撞電壓為35 eV。內(nèi)標監(jiān)測離子為m／z239.14→91.05［M＋H］＋，碰撞電壓為40 eV。

質(zhì)譜參數(shù)為：噴霧電壓4 000 eV；毛細管溫度350℃；鞘氣壓力30 psi（1 psi＝6 894.8 Pa）；反吹氣壓力1 psi；套管透鏡補償電壓67 V；源內(nèi)碰撞解析電壓8 V。

2.3 標準溶液及內(nèi)標溶液的配制

2.3.1 谷胱甘肽儲備液的配制 精密稱取樣品約10 mg，置 100 mL量瓶中，用稀釋液（乙腈-水-甲酸，50∶50∶0.1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL中約含谷胱甘肽0.1 mg的溶液作為母液，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 內(nèi)標標準品儲備液的配制 精密稱取甘氨酰酪氨酸約10 mg，置10 mL量瓶中，用稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每 1 mL中約含1.0 mg的溶液，作為母液，以稀釋液稀釋制成質(zhì)量濃度為50μg／mL的內(nèi)標儲備液。－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3 衍生化試劑溶液的配制 精密稱取MPTA約10 mg，置10mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL中約含1.0 mg的溶液，作為衍生化試劑，最終稀釋成0.1 mg／mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.3.4 谷胱甘肽-MPTA儲備液配制 將上述的谷胱甘肽儲備液與0.1 mg／mL的衍生化試劑進行反應，反應結(jié)束后加入過量的半胱氨酸與衍生化試劑反應。按照反應充分進行計算得到每1 mL中含谷胱甘肽衍生物0.1 mg的溶液作為母液。－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 前處理方法

2.4.1 方法學樣品前處理 精密吸取血漿樣品50μL，置1.5 mL塑料尖頭離心管中，精密加入谷胱甘肽-MPTA溶液及內(nèi)標溶液各5μL，加入乙腈100μL，旋渦 1 min后，4℃，12 000 r／min離心10 min，取上清液直接進樣，取上清液10μL進樣分析，按內(nèi)標法計算血漿樣品中谷胱甘肽的濃度。2.4.2 血漿樣品前處理 精密吸取血漿樣品50μL，置1.5 mL塑料尖頭離心管中，精密加入內(nèi)標溶液 5μL，加入衍生化試劑（0.1 mg／mL）100μL，20℃旋渦40min后4℃，12 000 r／min離心10 min，取上清液直接進樣，取上清液10μL進樣分析，按內(nèi)標法計算血漿樣品中谷胱甘肽的濃度。

3 結(jié) 果

3.1 方法專屬性

在本實驗所采用的色譜條件下，谷胱甘肽衍生物的出峰時間在2.85 min，內(nèi)標出峰時間在1.58 min，峰形良好，基線平穩(wěn)。本實驗考察了大鼠空白血漿及方法學低濃度點樣品色譜圖，結(jié)果表明方法特異性好，樣品和內(nèi)標測定不受干擾，專屬性結(jié)果見圖1。

Figure 1 Representative SRM chromatogramsof a blank plasma sample（A）；a blank plasma sample（B）；a blank plasma sample spiked with the internal standard（IS）（C）；and a blank plasma sample spiked with glutathione（GSH）at the limit of quantitation（3.000 ng／mL）（D）

3.2 線性范圍

精密吸取相關儲備液，配成模擬血漿質(zhì)量濃度為 3.000，10.00，30.00，100.0，300.0，1 000，2 000 ng／mL的血漿樣品。按照“2.4”項下方法學樣品處理方法同法處理，取10μL進樣分析，分別記錄谷胱甘肽衍生物的色譜峰面積（As）及內(nèi)標的色譜峰面積（Ai）。以谷胱甘肽衍生化產(chǎn)物峰面積與內(nèi)標峰面積的比值（As／Ai）為橫坐標，以GSH的質(zhì)量濃度c（ng／mL）為縱坐標，進行線性權重回歸（權重系數(shù)為1／c2）：3.000～2 000 ng／mL。在不同天處理5條標準曲線，分別為：y＝0.004 8x＋0.136 4；y＝0.008 0x－0.590 2；y＝0.004 4x＋0.266 7；y＝0.002 7x＋0.248 7；y＝0.005 5x－0.082 3。

血漿5條標準曲線平均比值回歸方程為c＝183×－0.323 4，相關系數(shù)r為 0.997 1。按上述方法血漿中谷胱甘肽的線性范圍為3.000～2 000 ng／mL，定量下限（LLOQ）定為標準曲線的最低濃度點，即3.000 ng／mL。

3.3 準確度

精密吸取血漿樣品50μL，置1.5 mL塑料尖頭離心管中，精密加入谷胱甘肽-MPTA溶液5μL，渦旋 30 s，制成含 10.00，100.0，1 000 ng／mL，谷胱甘肽-MPTA低、中、高3個質(zhì)量濃度的樣品。精密加入內(nèi)標溶液5μL，加入乙腈100μL，旋渦1 min后4℃，12 000 r／min離心10 min，取上清液直接進樣，取上清液10μL進樣分析，按內(nèi)標法計算血漿樣品中谷胱甘肽的濃度。連續(xù)測定5次，考察方法準確性。結(jié)果表明方法準確度良好，低、中、高3個質(zhì)量濃度的準確度在85%～115%之間，RSD在4.56%～13.91%之間。

3.4 提取回收率

樣品的制備：取空白血漿50μL置1.5 mL樣品管中，精密加入谷胱甘肽-MPTA標準品溶液，渦旋30 s混勻，分別制成含10.00，100.0和1 000 ng／mL，谷胱甘肽-MPTA的低、中、高3個濃度的樣品，每種濃度各5份，按照“2.4”項下方法學樣品處理方法同法處理，取10μL進樣分析。

對照品的制備：取空白血漿50μL，置1.5 mL塑料尖頭離心管中，加入100μL的乙腈，渦旋30 s，12 000 r／min，離心 5 min。于上清液中加入內(nèi)標5μL以及谷胱甘肽-MPTA標準溶液5μL，配制成濃度點為 10.00，100.0，1 000 ng／mL的樣品，渦旋1 min，12 000 r／min離心 5 min，取上清液作為對照低、中、高3個濃度各5份。

分別取上述溶液各10μL進樣。按As／Asr×100%計算樣品提取回收率，其中As為樣品溶液中谷胱甘肽衍生物的峰面積，Asr為對照溶液中谷胱甘肽衍生物的峰面積。按Ai／Air×100%計算內(nèi)標提取回收率，其中Ai為樣品溶液中內(nèi)標的峰面積，Air分對照溶液中內(nèi)標的峰面積。結(jié)果表明低、中、高3種質(zhì)量濃度的提取回收率均大于50%且穩(wěn)定。

3.5 基質(zhì)效應

3.5.1 基質(zhì)樣品的制備 取空白血漿50μL，置1.5 mL塑料尖頭離心管中，加入乙腈100μL，渦旋30 s，12 000 r／min，離心5 min。于上清液中加入內(nèi)標5μL以及GSH-MPTA標準溶液5μL，配制成質(zhì)量濃度為 10.00，100.0，1 000 ng／mL的樣品，渦旋1 min，12 000 r／min離心 5 min，取上清液進樣，低、中、高3個質(zhì)量濃度各5份。

3.5.2 對照樣品的制備 于1.5 mL離心管中分別精密加入含GSH-MPTA 100.0，1 000和10 000 ng／mL的標準品儲備液各5μL，加入PBS緩沖液50μL，渦旋30 s，制得低、中、高3個質(zhì)量濃度的對照樣品，每個質(zhì)量濃度各做5份，計算基質(zhì)效應。低、中、高質(zhì)量濃度測得基質(zhì)效應的比值分別為114.79%、107.54%和 105.93%，RSD分別為11.54%、7.89%和5.85%。上述結(jié)果表明谷胱甘肽在本實驗條件下不受基質(zhì)效應的影響，符合生物樣本測定的要求。

3.6 穩(wěn)定性考察

制備中濃度（100.0 ng／mL）的樣品 1份，按“2.4”項下血漿樣品前處理方法同法處理，立即取上清液10μL進樣，作為0 h的樣品溶液；將剩余的樣品溶液于4℃進樣器樣品盤中放置24 h后，取10μL進樣。由標準曲線求出各樣品的濃度，與0 h的相應濃度比較。由測定結(jié)果可知處理后的谷胱甘肽-MPTA進樣溶液放置于4℃的樣品盤上，12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，但24 h后樣品降解較為嚴重。

3.7 方法應用

將上述建立的方法對實際大鼠空白血漿中內(nèi)源性谷胱甘肽進行檢測。選取6批大鼠空白血漿，按“2.4”項下血漿樣品前處理方法同法處理后，取10μL進樣測定，結(jié)果見表1。

Table 1 Determination of endogenous glutathione（GSH）in rat′s plasma

4 討 論

4.1 衍生化試劑的選擇

在內(nèi)源性谷胱甘肽的測定中，血漿中大量的含巰基內(nèi)源性蛋白會對樣品的衍生化產(chǎn)生較大的干擾。為避免這一干擾，本研究選用MPTA作為衍生化試劑。內(nèi)源性蛋白相對分子質(zhì)量大，立體位阻大，難以在同樣條件下與MPTA反應。谷胱甘肽的離子化效率較低以及基質(zhì)抑制都使得樣品的質(zhì)譜響應較低，MPTA在谷胱甘肽衍生化產(chǎn)物中同時引入了季銨基團和烷基鏈。季銨基團自身帶一個正電荷，在質(zhì)譜中響應很高；烷基鏈能夠增加疏水性，以此增加衍生化產(chǎn)物的離子化效率。因此極大提高了本方法對谷胱甘肽測定的靈敏度，最終定量下限可達到10 pmol／L左右。此外，衍生化試劑MPTA所含的馬來酰亞胺基團與谷胱甘肽中的巰基發(fā)生邁克爾加成反應，該反應十分迅速，條件溫和，并且能夠避免半胱氨酸中的殘基與血漿中內(nèi)源性物質(zhì)生產(chǎn)二硫鍵，從而提高了樣品穩(wěn)定性，成功解決了目前衍生化法存在的操作繁瑣、耗時較長、重復性差等問題。衍生化試劑結(jié)構(gòu)及反應如圖2所示。

Figure 2 Derivatization of GSH with 4-（N-maleimido）phenyl trimethylammonium iodide（MPTA）

4.2 谷胱甘肽衍生化條件優(yōu)化

本實驗中，對衍生化條件進行優(yōu)化，考察溫度、反應時間及衍生化試劑的濃度對反應的影響。每個條件下平行配制6份樣品，根據(jù)峰面積及峰面積的RSD選擇最優(yōu)的反應條件。谷胱甘肽選擇質(zhì)量濃度為300.0 ng／mL。由表2可知，衍生化試劑濃度越大對谷胱甘肽的影響較大，隨著質(zhì)量濃度增加，其峰面積反而越來越小，推測由于衍生化試劑與多肽樣品之間存在離子抑制。在反應時間為40 min，衍生化溫度為30℃的實驗條件下，根據(jù)峰面積大小及RSD的比較，選擇0.1 mg／mL的衍生化試劑濃度。反應時間對峰面積的影響不是太大，但是對峰面積的穩(wěn)定性影響比較大，在反應溫度40℃，衍生化試劑質(zhì)量濃度為0.1 mg／mL，結(jié)合峰面積大小及峰面積的RSD選擇反應時間為40 min。反應溫度結(jié)果顯示，在40 min、衍生化試劑質(zhì)量濃度為0.1 mg／mL反應溫度為20℃的反應條件下，其峰面積最穩(wěn)定。因此，最終確定的反應條件為反應溫度20℃，反應時間40 min，衍生化試劑的質(zhì)量濃度為0.1 mg／mL。

Table 2 Effect of various factors on GSH derivatization

Effect factors Level Peak areas RSD／%c（MPTA）0.1 mg／mL 115 022 10.75 0.5 mg／mL 178 397 12.61 1.0 mg／mL 118 265 11.44 1.5 mg／mL 153 133 11.05 t R 10 min 124 891 34.74 20 min 105 890 27.97 30 min 119 437 41.53 40 min 131 658 11.47 Reaction temperature 10℃ 202 540 40.90 20℃ 238 615 13.76 30℃ 193 329 28.88 40℃ 6 512 48.29

4.3 色譜條件的選擇

由于巰基的存在，使得谷胱甘肽具有很強的極性和水溶性。在以往液相色譜檢測谷胱甘肽過程中，較常采用的是反相C18色譜柱，但這種色譜柱對強極性的化合物保留很弱。因此，本實驗選用保留有機不同的親水作用色譜（HILIC）體系。該體系采用高比例的有機相及少量的水相組成二元流動相，在極性的固定相上進行洗脫分析，高揮發(fā)有機相具有較低的離子抑制尤其適宜與電噴霧（ESI）聯(lián)用，提高了質(zhì)譜檢測的靈敏度［17］。同時，高比例有機相具有低黏度和高滲透性的特點，與相似柱粒徑和流速的RPLC相比，色譜柱壓大大降低，因此可以獲得較高的色譜柱效和對稱的峰型，從而實現(xiàn)快速分析。流動相為乙腈-水（含0.1%甲酸）（75∶25）時，谷胱甘肽在Zorbax HILIC PLUS色譜柱上保留時間合適，色譜峰形良好并且能與內(nèi)標物有效分離。

4.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

谷胱甘肽與MPTA衍生化后，產(chǎn)物相對分子質(zhì)量為537，其在正離子模式下容易產(chǎn)生（M＋H）＋峰，根據(jù)流動注射實驗結(jié)果確定其正負離子模式及單／多電荷峰。谷胱甘肽產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量為537，其母離子為MSm／z538.20，兼顧離子響應靈敏度高與穩(wěn)定性好兩個方面選擇監(jiān)測子離子為MSm／z265.02，碰撞電壓為35 eV。選擇甘氨酰酪氨酸作為內(nèi)標，其母離子同樣為單電荷，兼顧離子響應靈敏度與穩(wěn)定性，選擇內(nèi)標的監(jiān)測離子對為MSm／z239.14→91.05，碰撞電壓為40 eV。谷胱甘肽原型相對分子質(zhì)量為307，其母離子為 MSm／z308.06，兼顧離子響應靈敏度高與穩(wěn)定性好兩個方面選擇監(jiān)測子離子為MSm／z179.00，碰撞電壓為25 eV。質(zhì)譜參數(shù)為：噴霧電壓4 000 eV；毛細管溫度350℃；鞘氣壓力30 psi；反吹氣壓力1 psi；套管透鏡補償電壓67 V；源內(nèi)碰撞解析電壓8 V。

5 小 結(jié)

本研究建立了衍生化LC-MS／MS測定血漿中的內(nèi)源性谷胱甘肽的方法，在3.000～2 000 ng／mL范圍內(nèi)線性良好，相關系數(shù)r大于0.99；定量下限的精密度和準確度均符合要求；低濃度樣品的準確度在80%～120%之間，中，高濃度的準確度在85%～115%之間；處理后的進樣溶液放置于4℃的樣品盤上，在12 h內(nèi)的穩(wěn)定。最終測得大鼠血漿中內(nèi)源性谷胱甘肽質(zhì)量濃度在10 ng／mL左右?？紤]到谷胱甘肽為血漿中內(nèi)源性物質(zhì)，實驗過程中先對谷胱甘肽對照溶液進行衍生化處理，并將多余的MPTA與半胱氨酸反應，之后加入空白基質(zhì)中進行方法學驗證，其中內(nèi)源性的半胱氨酸并不會干擾測定。本研究建立的衍生化方法可以快速準確地對血漿中谷胱甘肽進行測定，并且能夠增加多肽的質(zhì)譜響應，提高方法靈敏度。同時，具有前處理操作簡單、使用試劑種類較少、反應效率高等優(yōu)點。

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