于天弘，Siva Bharath MERUGU＃，Hema NEGI＃，孫宋暄，丁云鶴，武正華*，李大偉，3**

（上海交通大學(xué) 1藥學(xué)院，上海200240；2生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院；3細(xì)胞工程及抗體藥物教育部工程研究中心，上海200240）

前梯度蛋白2（anterior gradient2，AGR2）是蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）家族的成員，具有促進(jìn)蠑螈斷肢再生［1］、皮膚傷口愈合［2］和在胰腺組織再生的過(guò)程中激活表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路等作用［3］。AGR2也是一種腫瘤相關(guān)蛋白，在乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌等腫瘤組織中過(guò)表達(dá)［4－8］。細(xì)胞內(nèi)AGR2在腫瘤中與腫瘤增殖、存活、遷移、黏附、不良預(yù)后、耐藥等特性息息相關(guān)［9－12］。另外，在腫瘤組織中，AGR2可以被分泌至細(xì)胞外并能在腫瘤病人的血液和尿液中被檢測(cè)到［13－14］。細(xì)胞外的AGR2是腫瘤微環(huán)境中的重要參與者，已知的功能有導(dǎo)致前列腺基質(zhì)細(xì)胞的程序性死亡［15］，影響上皮細(xì)胞的極性和黏附，引起上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［16］，與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）結(jié)合，增強(qiáng) VEGF和 FGF形成二聚體的能力，繼而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞向腫瘤組織遷移，引起血管生成［17］。這些特性都說(shuō)明AGR2是一個(gè)潛在的抗腫瘤靶點(diǎn)。

本課題組通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備了以AGR2為靶點(diǎn)的單克隆抗體，命名為18A4［18］。初步藥效實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，18A4能夠抑制AGR2表達(dá)陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移［19］，通過(guò)抑制血管生成的功能減緩了SKOV3卵巢癌細(xì)胞的裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)［17，20］。但18A4的藥理活性研究仍然存在拓展的空間。本研究運(yùn)用兩種自身不表達(dá)AGR2的黑色素瘤細(xì)胞，將AGR2蛋白和18A4同時(shí)作用于細(xì)胞，觀察18A4抗體能否抑制細(xì)胞外AGR2引起的腫瘤細(xì)胞活性。

1 材 料

1.1 試 劑

單克隆抗體18A4，His標(biāo)簽AGR2蛋白由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、表達(dá)、純化［2，18］。人黑色素瘤細(xì)胞 A375，小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10購(gòu)自美國(guó)ATCC中心。DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清、青霉素-鏈霉素混合液；MTT、結(jié)晶紫（索萊寶生物科技有限公司）；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽、DAPI（美國(guó)Millipore公司）；兔抗人p53抗體（美國(guó)Proteintech公司）；鼠抗β-actin抗體（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司）；IRDye 680CW標(biāo)記的羊抗兔抗體、IRDye 800CW標(biāo)記的羊抗鼠抗體（美國(guó)Odyssey公司）；Dylight488，Dylight594標(biāo)記的羊抗兔抗體（聯(lián)科生物有限公司）。

1.2 儀 器

FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)徠卡公司）；Odyssey雙色紅外激光成像儀（美國(guó)Li-Cor有限公司）。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

A375和B16-F10細(xì)胞分別在含10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基，37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移、細(xì)胞形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)分成空白對(duì)照組和AGR2組（50，100 ng／mL）；18A4組（20μg／mL）及 AGR2＋18A4組（100 ng／mL AGR2＋20μg／mL 18A4）。Western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)分成空白對(duì)照組和阿霉素組（1μmol／L）；阿霉素＋AGR2組（1μmol／L阿霉素 ＋100 ng／mL AGR2）及阿霉素 ＋AGR2＋18A4組（1μmol／L阿霉素 ＋100 ng／mL AGR2＋20μg／mL 18A4）。

2.2 MTT法檢測(cè)AGR2和18A4抗體對(duì)A375和B16-F10細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板。37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，加藥，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后每孔加入5 mg／mL MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150μL，振蕩10 min使結(jié)晶溶解。酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm下的吸收度，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率：抑制率＝（對(duì)照組吸收度的平均值－實(shí)驗(yàn)組吸收度的平均值）／（對(duì)照組吸收度的平均值）×100%。

2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)AGR2和18A4抗體對(duì)A375和B16-F10細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔2×103個(gè)細(xì)胞接種于6孔板。37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，加藥。37℃、5%CO2培養(yǎng)10 d。吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌后每孔加入0.5%結(jié)晶紫500μL，染色30 min。PBS洗滌，拍照，計(jì)數(shù)。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)AGR2和18A4抗體對(duì)A375和B16-F10細(xì)胞周期的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板。37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，加藥。37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。胰酶消化收集所有細(xì)胞，70%乙醇固定過(guò)夜。PBS洗滌后PI染色，37℃避光水浴30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AGR2和18A4抗體對(duì)A375和B16-F10細(xì)胞遷移的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板。37℃、5%CO2培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)滿。換成0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基刺激24 h。用200μL槍頭在孔內(nèi)劃痕，PBS洗滌后加藥，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。在0 h和24 h，每個(gè)劃痕拍照4張，分析兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上劃痕寬度的變化。

2.6 鬼筆環(huán)肽染色檢測(cè)AGR2和18A4抗體對(duì)A375和B16-F10細(xì)胞形態(tài)的改變

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于含細(xì)胞爬片的12孔板。37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。加藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS洗滌后取細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌后加羅丹明交聯(lián)的鬼筆環(huán)肽，避光染色45 min。PBS洗滌，DAPI避光染色5 min?？篃晒獯銣鐒┓馄す夤簿劢癸@微鏡鏡檢，拍照。

2.7 Western blot檢測(cè) AGR2和 18A4抗體對(duì)A375和B16-F10細(xì)胞中p53表達(dá)量的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板。37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。加藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。胰酶消化收集所有細(xì)胞，PBS洗滌后加入預(yù)冷、含蛋白酶抑制劑的NP40細(xì)胞裂解液裂解，每個(gè)樣品中加入等體積的5×上樣緩沖液，混勻，95℃水浴5 min，－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。樣品?jīng)10%SDS-PAGE分離，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，恒流300 mA轉(zhuǎn)膜1 h。在5%脫脂奶中室溫振蕩封閉1 h。加1∶1 000稀釋的兔抗人p53抗體，鼠抗β-actin抗體，4℃孵育過(guò)夜，TNET溶液洗膜10 min×3次。加1∶5 000稀釋的IRDye 680CW標(biāo)記的羊抗兔抗體或IR Dye 800CW標(biāo)記的羊抗鼠抗體，室溫孵育1 h，TNE-T溶液（10 mmol／L Tris-base，2.5 mmol／L EDTA-2Na，50 mmol／L NaCl，0.1%Tween-20）洗膜 10 min×3次。雙色紅外激光成像儀掃膜，用Quantity One軟件分析蛋白條帶的深淺。

2.8 免疫熒光分析AGR2和18A4抗體對(duì)A375和B16-F10細(xì)胞中p53表達(dá)量的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于含細(xì)胞爬片的12孔板。37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。加藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS洗滌后取細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%Triton X-100通透15 min，5%羊血清封閉1 h。加1∶200稀釋的兔抗人p53抗體，室溫孵育2 h，PBS洗滌。加1∶500稀釋的 Dylight488或Dylight594標(biāo)記的羊抗兔抗體，室溫避光孵育1 h，PBS洗滌。DAPI避光染色5 min，抗熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡鏡檢，拍照。

2.9 數(shù)據(jù)分析

用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)兩組樣本采用Student′sT-test比較差異顯著性。P＜0.05表示有顯著性差異。

3 結(jié) 果

3.1 18A4抗體對(duì)胞外AGR2引起的細(xì)胞增殖加快的抑制作用

運(yùn)用MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞外AGR2和18A4對(duì)兩種黑色素瘤細(xì)胞A375和B16-F10增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入50 ng／mL AGR2刺激24 h僅顯著加快B16-F10的增殖，而100 ng／mL AGR2能同時(shí)顯著提高A375和B16-F10細(xì)胞的增殖，分別高于對(duì)照組生長(zhǎng)率（34.74±7.69）%和（29.87±5.02）%。而在加入100 ng／mL AGR2的基礎(chǔ)上加入20μg／mL 18A4，與 AGR2組相比，兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)率均有顯著的降低，分別降低了（43.99±5.93）%和（33.63±6.48）%，如圖1所示。

用克隆形成實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證MTT實(shí)驗(yàn)的現(xiàn)象。與對(duì)照組相比，100 ng／mL AGR2單獨(dú)作用后，A375和B16-F10細(xì)胞形成克隆的數(shù)量分別顯著增加了（49.00±7.12）%和（36.67±7.77）%。而在100 ng／mL AGR2和20μg／mL 18A4同時(shí)作用的條件下，A375和B16-F10細(xì)胞形成克隆的數(shù)量與AGR2組相比分別減少了（32.00±8.64）%和（27.33±8.50）%，如圖1C，1D所示。兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均表明18A4抗體能抑制胞外AGR2引起的腫瘤細(xì)胞增殖加快。

Figure 1 Monoclonal antibody 18A4 blocked the proliferation enhancement induced by extracellular AGR2 in melanoma cells（ˉx±s，n＝3）A：MTT assay of AGR2 and mab 18A4 on the proliferation of A375 cells；B：MTT assay of AGR2 andmab 18A4 on the proliferation of B16-F10 cells；C：Colony formation assay of A375 and B16-F10 cells treated with AGR2，18A4 or a combination of them；D：Quantification of colony numbers in histograms*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs control group，＃P＜0.05；＃＃＃P＜0.001 vs AGR2 group

3.2 18A4抗體對(duì)胞外AGR2引起的細(xì)胞周期改變的抑制作用

細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)，故通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞外AGR2與18A4抗體對(duì)兩種黑色素瘤細(xì)胞周期的影響。與對(duì)照組相比，AGR2組細(xì)胞的G1期比例分別減少了（10.02±1.92）%和（7.73±1.70）%，S期比例分別增加了（9.09±1.85）%和（8.01±1.23）%，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明 AGR2組與對(duì)照組存在顯著性差異。所以胞外AGR2能引起腫瘤細(xì)胞G1／S細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化。而與AGR2組相比，AGR2＋18A4組細(xì)胞的G1期比例分別增加了（7.39±1.37）%和（7.60±1.40）%，S期比例分別減少了（6.78±1.12）%和（6.76±0.78）%，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明AGR2＋18A4組與AGR2組存在顯著性差異，如圖2所示。所以18A4抗體能抑制胞外AGR2引起的G1／S細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化。

Figure 2 Monoclonal antibody 18A4 hindered the cell cycle transition induced by extracellular AGR2 in melanoma cells（ˉx±s，n＝3）A：Flow cytometry analysisof AGR2 andmab 18A4 on the cell cycle of A375 cells；B：Flow cytometry analysisof AGR2 andmab 18A4 on the cell cycle of B16-F10 cells；C：Statistical analysis of G1 and S phase distributions in histograms*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs AGR2 group

3.3 18A4抗體對(duì)胞外AGR2引起的細(xì)胞遷移加快和細(xì)胞形態(tài)變化的抑制作用

通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分析胞外AGR2和18A4抗體對(duì)細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果表明，AGR2組細(xì)胞的遷移速度分別比對(duì)照組細(xì)胞提高了（27.88±8.61）%和（49.81±10.64）%，兩組間有顯著性差異。而AGR2＋18A4組細(xì)胞的遷移速度分別比AGR2組細(xì)胞降低了（21.21±8.36）%和（40.21±10.22）%，兩組間有顯著性差異，如圖 3A～3D所示。

細(xì)胞遷移與細(xì)胞形態(tài)的變化相關(guān)，進(jìn)一步用鬼筆環(huán)肽染色法觀察AGR2和18A4抗體對(duì)兩種黑色素瘤細(xì)胞形態(tài)的影響。研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組上皮細(xì)胞形態(tài)相比，AGR2組的細(xì)胞均呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，而AGR2＋18A4組的細(xì)胞仍然維持上皮細(xì)胞的形態(tài)（圖3E，3F），說(shuō)明胞外AGR2能夠改變腫瘤細(xì)胞的形態(tài)，而18A4抗體能抑制 AGR2的這一作用。

3.4 18A4抗體對(duì)胞外AGR2引起的p53表達(dá)量變化的抑制作用

選擇檢測(cè)抑癌基因p53的表達(dá)量來(lái)觀察胞外AGR2和18A4抗體對(duì)細(xì)胞信號(hào)的影響。為了更清晰地觀察p53表達(dá)量的變化，加入1μmol／L阿霉素來(lái)增加p53的表達(dá)量。Western blot結(jié)果顯示，阿霉素組A375和B16-F10細(xì)胞的p53表達(dá)量分別達(dá)到對(duì)照組表達(dá)量的（8.41±1.91）倍和（5.90±0.94）倍，上調(diào)明顯。與阿霉素組相比，阿霉素＋AGR2組細(xì)胞的p53表達(dá)量又明顯降低，分別是阿霉素組p53表達(dá)量的（27.33±4.15）%和（25.50±7.39）%，兩組間有顯著性差異，說(shuō)明胞外AGR2降低了p53的表達(dá)量。而阿霉素＋AGR2＋18A4組細(xì)胞p53表達(dá)量與阿霉素＋AGR2組相比有明顯的回升，分別是阿霉素＋AGR2組p53表達(dá)量的（3.22±0.57）倍和（3.85±1.09）倍，兩組間有顯著性差異，說(shuō)明胞外AGR2對(duì)p53表達(dá)量的影響被18A4抗體中和，如圖4A～4D所示。

為了再次驗(yàn)證Western blot的結(jié)果，進(jìn)一步用免疫熒光染色法檢測(cè)各組細(xì)胞的p53表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Western blot的結(jié)果類(lèi)似，同時(shí)在兩種細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)，阿霉素明顯提升了熒光強(qiáng)度，即p53表達(dá)量。阿霉素＋AGR2組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度與阿霉素組相比明顯回落，而阿霉素＋AGR2＋18A4組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度又明顯回升，如圖4E，4F所示。Western blot和免疫熒光的結(jié)果均說(shuō)明胞外AGR2引起腫瘤細(xì)胞p53表達(dá)量降低的現(xiàn)象能被18A4抗體所抑制。

Figure 3 Monoclonal antibody 18A4 decreased themigration acceleration and morphological changes induced by extracellular AGR2 inmelanoma cellsA：Wound healing assay of AGR2 and mab 18A4 on themigration of A375 cells；B：Statistical analysis of A375 cellmigration in histograms；C：Wound healing assay of AGR2 andmab 18A4 on themigration of B16-F10 cells；D：Statistical analysisof A375 cellmigration in histograms；E：Cellmorphology staining of A375 cells with corresponding treatments；F：Cellmorphology staining of B16-F10 cells with corresponding treatments*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs AGR2 group

Figure 4 Monoclonal antibody 18A4 masked the decline of p53 expression level induced by external AGR2A：Western blot analysis of p53 expression in A375 cells with corresponding treatments；B：Western blot analysis of p53 expression in B16-F10 cells with corresponding treatments.β-actin was served as an internal control；C：Statistical analysis of the band intensities on Western blots as compared to β-actin bands in A375 cells；D：Statistical analysisof the band intensities onWestern blotsas compared toβ-actin bands in B16-F10 cells；E：Immunofluorescence assay of p53 expression in A375 cells；F：Immunofluorescence assay of p53 expression in B16-F10 cells*P＜0.05 vs control group；＃P＜0.05 vs AGR2 group

4 討 論

AGR2在多種腫瘤組織中過(guò)表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外AGR2均與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥等有關(guān)，所以AGR2是一個(gè)潛在的抗腫瘤靶點(diǎn)。雖然科學(xué)家們已經(jīng)提出了若干種抑制AGR2功能的策略，但是針對(duì)AGR2的藥物至今尚未出現(xiàn)［21］。故本研究探究了以AGR2為靶點(diǎn)18A4抗體能否抑制細(xì)胞外AGR2引起的腫瘤細(xì)胞活性。

首先通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了18A4抗體能夠抑制細(xì)胞外AGR2引起的腫瘤細(xì)胞增殖加快，并進(jìn)一步檢測(cè)胞外AGR2與18A4對(duì)細(xì)胞周期的影響。敲降細(xì)胞內(nèi)AGR2能夠讓乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞阻滯在 G1期［22－23］，但胞外 AGR2能否影響細(xì)胞周期還是未知的。本研究中細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明胞外AGR2的刺激能夠減少G1期細(xì)胞，增加S期細(xì)胞。更重要的，胞外AGR2對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的調(diào)控能被18A4抗體抑制。

AGR2與腫瘤細(xì)胞的遷移有著緊密的聯(lián)系。敲降胞內(nèi)AGR2可減慢腫瘤細(xì)胞的侵襲性，反之，將AGR2轉(zhuǎn)染入腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)［8，24－25］。同樣的，胞外 AGR2促進(jìn)了上皮細(xì)胞的遷移，引起 EMT，加快傷口愈合［2，16］。所以本研究通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞形態(tài)染色檢測(cè)18A4能否緩解胞外AGR2導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞遷移加快和細(xì)胞形態(tài)變化。本研究結(jié)果證實(shí)18A4抗體具有減緩胞外AGR2引起的細(xì)胞遷移加快和形態(tài)變化。

p53是經(jīng)典的抑癌基因，超過(guò)半數(shù)的腫瘤組織中存在p53的突變和缺失［26］。Hrstka等［27］發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)AGR2通過(guò)雙特異性磷酸酶10（DUSP10，dual specificity protein phosphatase 10）的調(diào)控降低p53的活性，但胞外AGR2能否影響p53的表達(dá)還是未知的。本研究用阿霉素處理腫瘤細(xì)胞以增加p53的表達(dá)量，通過(guò)Western blot和免疫熒光染色說(shuō)明胞外AGR2的刺激能夠降低 p53的表達(dá)量，而18A4抗體能夠穩(wěn)定p53的表達(dá)量，抑制AGR2對(duì)p53表達(dá)量的影響。

綜上所述，18A4抗體能夠抑制胞外AGR2引起的腫瘤細(xì)胞活性，包括增殖速度加快、G1／S細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變、遷移速度加快、細(xì)胞形態(tài)的改變和p53表達(dá)量的降低，這些結(jié)果不僅延伸了18A4的藥理作用，也說(shuō)明18A4是一種潛在的抗腫瘤藥物。

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