胡 林，童 煥，丁 茹，王湛博，尤淋君，楊 勁*

（中國藥科大學(xué) 1藥物代謝動力學(xué)研究中心，南京210009；2新藥安全評價研究中心，南京211198）

水飛薊素是菊科植物水飛薊（Silybum marianum（L.）Gaertn.）干燥果實的活性提取物。水飛薊賓（silybin）是水飛薊素的黃酮木質(zhì)素類化合物的主要活性成分［1］，水飛薊賓葡甲胺為水飛薊賓的成鹽衍生物，結(jié)構(gòu)見圖1。水飛薊賓是公認(rèn)的具有保肝作用的藥物，在國內(nèi)臨床上應(yīng)用于急慢性肝炎、脂肪肝的肝功能異常的恢復(fù)。目前國內(nèi)市售的制劑有水飛薊賓膠囊和水飛薊賓葡甲胺片，其中膠囊劑是水飛薊賓和卵磷脂復(fù)合物［2］。水飛薊賓具有低水溶性和低脂溶性的物理特性，原料藥口服生物利用度低［3］。通過在比格犬體內(nèi)比較市售的水飛薊賓膠囊和水飛薊賓葡甲胺片、水飛薊賓原料藥羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）混懸液的絕對生物利用度（bioavailablity，BA）發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓原料藥的絕對BA小于5%，膠囊劑和成鹽片劑的絕對BA相比于原料藥有很大的提高，但兩者提高BA的程度有較大差異（結(jié)果另文發(fā)表）。目前僅有少數(shù)文獻有部分水飛薊賓的吸收機制的相關(guān)報道。水飛薊賓的胃腸道吸收分?jǐn)?shù)為20%～47%［4］，在大鼠單向腸灌流試驗中發(fā)現(xiàn)水飛薊賓在小腸吸收良好［5－6］，水飛薊賓的表觀滲透系數(shù)（Papp（AP-BL））約為3×10－7cm／s［7］，跨膜通透性低。這些研究結(jié)果不全面、不系統(tǒng)、機制不明確，且結(jié)論彼此矛盾。已證實藥物在Caco-2單層細(xì)胞的滲透性與藥物在人體中胃腸道吸收有良好的相關(guān)性，它是預(yù)測藥物在人體吸收的金標(biāo)準(zhǔn)［8－9］。因此，本實驗采用 Caco-2單層細(xì)胞模型研究不同濃度的水飛薊賓和水飛薊賓葡甲胺的雙向跨膜轉(zhuǎn)運通透性，為進一步改良水飛薊賓的劑型，增加生物利用度，并減少生物利用度的變異提供理論基礎(chǔ)。

Figure 1 Structure of silybin and silybin-N-meglumine

1 材 料

1.1 藥品和細(xì)胞株

水飛薊賓原料藥（純度：98%，南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司）；水飛薊賓葡甲胺原料藥（純度：83.45%，南京宸翔醫(yī)藥研究有限責(zé)任公司）；氯唑沙宗對照品（純度：99.99%，批號：100364-201302，中國食品藥品檢定研究院）；熒光黃［西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司］；鹽酸普萘洛爾（純度：99.00%）、阿替洛爾（純度：99.00%）購于 Biochemistry公司；Caco-2細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫，實驗中所用的代數(shù)在20～45代之間。

1.2 試劑和材料

DMEM培養(yǎng)基（含 4.0 mmoL／L谷氨酰胺，4 500 mg／L葡萄糖）、胎牛血清（以色列Biological Industries公司）；青鏈霉素（美國 Hyclone公司）；0.25%胰蛋白酶、非必需氨基酸（美國 Gibco公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（色譜純，美國ROE Scientific公司）；其他試劑均為分析純；Millicell懸掛式培養(yǎng)小室（材料：聚酯膜，孔徑：1.0μm，膜面積：0.3 cm2；美國 Millipore公司）；培養(yǎng)皿、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（上海圣納堡生物科技開發(fā)有限公司）。

1.3 儀 器

LC／MS／MS液質(zhì)聯(lián)用儀（4000 Q-Trap質(zhì)譜儀，美國AB公司；Agilent 1290超高效液相儀，美國Agilent公司）；跨膜電阻儀（Millcell?-ERS-2，美國Millipore公司）；恒溫振蕩儀（浙江卓恒公司）；生物安全柜和CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；細(xì)胞計數(shù)儀（美國Nexcelom Bioscience公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國Perkin Elmer公司）。

2 方 法

2.1 HBSS緩沖液中水飛薊賓的檢測

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Kinetex XB-C18（2.1×50 mm，2.6μm，Phenomenex公司）；流速：0.3 mL／min；柱溫：30℃；進樣盤溫度：6℃；進樣體積10μL；洗針液：甲醇-水（1∶1）；流動相：純水（含0.1%甲酸，A相）；乙腈（B相）；梯度洗脫：0～0.5 min，20%B；0.5～1 min，20～65%B；1～2.4 min，65%B，2.4～2.5min，65% ～90%B；2.5～3.4 min，90%B；3.4～3.5 min，90% ～20%B；3.5～4.5 min，20%B。

2.1.2 質(zhì)譜方法 離子采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）?？倳r間4.5 min，切入質(zhì)譜時間為1.2 min，切出質(zhì)譜時間為2.8 min。氣路參數(shù)：CUR：25 psi（1 ps＝6 894.8 Pa）；IS：－4 500 V；TEM：500℃；GS1：50 psi；GS2：50 psi?；衔飬?shù)：水飛薊賓：定量離子對 481.2／300.8；DP：－100 V；CE：－28 V；CXP：－15 V；EP：－10 V。氯唑沙宗（內(nèi)標(biāo)）：定量離子對 168.1／131.7；DP：－65 V；CE：－27.6 V；CXP：－6 V；EP：－10 V。

2.1.3 水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的制備 精密稱取2份水飛薊賓10.20 mg于10 mL量瓶中，用乙腈定容到刻度線，即得1 mg／mL的母液。其中一份稀釋為標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：0.02，0.1，0.2，1，2，10，20，30μg／mL。另一份稀釋為質(zhì)控樣品工作液：0.04，1.6，8，24μg／mL。分別精密移取標(biāo)曲工作液和質(zhì)控工作液10μL，加細(xì)胞溫孵過空白HBSS緩沖液190μL，渦旋混勻，即得模擬標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（1，5，10，50，100，500，1 000，1 500 ng／mL）和質(zhì)控樣品（2，80，400，1 200 ng／mL）。

2.1.4 前處理方法 移液槍移取樣品30μL加氯唑沙宗乙腈溶液（內(nèi)標(biāo)，54 ng／mL）10μL，混勻后，加乙腈（析出緩沖鹽）270μL渦旋混勻，12 000 r／min，4℃，離心 5 min，取上清液 75μL與超純水75μL混勻進樣。

2.2 HBSS緩沖液中阿替洛爾和普萘洛爾的檢測

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm×50 mm，2.7μm）；流速：0.3 mL／min；柱溫：30℃；進樣盤溫度：6℃；進樣體積5μL；洗針液：甲醇-水（1∶1）；流動相：純水（含0.1%甲酸，A相）；乙腈（B相）；梯度洗脫：0～0.6 min，10%B；0.6～0.8min，10% ～65%B；0.8～2.4min，65%B，2.4～2.5min，65% ～90%B；2.5～3.1min，90%B；3.1～3.2 min，90% ～10%B；3.2～4.5 min，10%B。

2.2.2 質(zhì)譜方法 氣路參數(shù)：CUR：28 psi；IS：4 500 V；TEM：400℃；GS1：10 psi；GS2：10 psi?；衔飬?shù)：阿替洛爾：定量離子對267.6／145.3；DP：60 V；CE：40 V；CXP：13 V；EP：15 V。普萘洛爾：定量離子對 260.6／116.4；DP：47 V；CE：25 V；CXP：10 V；EP：10 V。奧美拉唑（內(nèi)標(biāo)）：定量離子對346.7／198.3；DP：35 V；CE：15 V；CXP：10 V；EP：10 V。總時間4.5 min，切入質(zhì)譜時間為0.5 min，切出質(zhì)譜時間為2.5 min。

2.2.3 普萘洛爾和阿替洛爾的標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的制備 精密稱取阿替洛爾10.00 mg、鹽酸普萘洛爾11.45 mg，分別放置于10 mL量瓶中，用甲醇定容到刻度線，即得1 mg／mL的母液。分別精密移取阿替洛爾母液（1 mg／mL）和普萘洛爾母液（1mg／mL）1mL置于10mL量瓶中，用甲醇定容到刻度線即得100μg／mL的混合母液。使用混合母液依次稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：0.04，0.1，0.2，0.4，1，2，4，10μg／mL。按上述操作制備另一份混合母液依次稀釋為質(zhì)控樣品工作液：0.1，0.8，8μg／mL。分別精密移取標(biāo)曲工作液和質(zhì)控工作液10μL，加細(xì)胞溫孵過空白HBSS緩沖液190μL，渦旋混勻，即得模擬標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和質(zhì)控樣品。

2.3 熒光黃的檢測

精密稱取熒光黃15.65 mg于100 mL量瓶中，使用HBSS緩沖液定容至刻度，即得300μmol／L熒光黃溶液。用HBSS逐級稀釋300μmol／L熒光黃為 5，10，50，100，500，1 000 nmol／L標(biāo)曲工作溶液，采用多功能酶標(biāo)儀，激發(fā)波長466 nm，發(fā)射波長522 nm測量標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的熒光強度。

2.4 Caco-2細(xì)胞模型的建立和評價

小室中的接種與培養(yǎng)：取狀態(tài)良好的復(fù)蘇第4代之后的細(xì)胞，用細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，并調(diào)整細(xì)胞密度至每毫升1.0×105個，接種24 h后更換培養(yǎng)液，第1周隔天換液，1周后每天換液，培養(yǎng)21 d。細(xì)胞單層完整性的形成：將Caco-2細(xì)胞按上述接種密度接種到直徑為35 mm的培養(yǎng)皿，在接種后第1，3，7，12，21天使用倒置顯微鏡拍照。細(xì)胞單層致密性的形成：使用Millicell?-ERS跨膜電阻儀測定Caco-2細(xì)胞接種到小室后的第1，3，7，12，21天的電阻值。檢測細(xì)胞單層的滲透性：測定300μmol／L熒光黃AP-BL側(cè)的通透性。

2.5 給藥組和陽性對照組的轉(zhuǎn)運實驗

2.5.1 藥物的配制

給藥組：分別精密稱取水飛薊賓102.04 mg和水飛薊賓葡甲胺119.83 mg于10 mL量瓶中，用DMSO溶液定容至刻度線即得10 mg／mL的母液。分別將給藥組母液用HBSS緩沖液稀釋成：水飛薊賓 HBSS（5，20，50μg／mL）；水飛薊賓葡甲胺 HBSS（28μg／mL，體系中的 DMSO含量最終不超過0.5%）。

陽性對照組：分別精密稱取鹽酸普萘洛爾148.00 mg和阿替洛爾133.20 mg于10 mL量瓶中，用甲醇定容到刻度線即得50 mmoL／L的母液，轉(zhuǎn)運實驗時取上述母液50μL于50 mL量瓶中，用HBSS緩沖液分別稀釋1 000倍即得所需實驗濃度的普萘洛爾（50μmoL／L）和阿替洛爾（50μmoL／L）的HBSS溶液。

2.5.2 最大藥物濃度和溶劑對單層電阻值的影響

細(xì)胞在小室中培養(yǎng)21 d后，分別在給予50μg／mL水飛薊賓的1 h和2 h測定Caco-2細(xì)胞單層的電阻值。給藥2 h后將給藥孔兩側(cè)更換為細(xì)胞培養(yǎng)液，在更換培養(yǎng)基后24 h再次測定給藥孔的電阻。

2.5.3 正式轉(zhuǎn)運實驗 小室中細(xì)胞培養(yǎng)21 d后，選取電阻合格的孔室進行正式的轉(zhuǎn)運實驗。取出細(xì)胞板后倒掉小室兩側(cè)的培養(yǎng)基，用HBSS清洗3次，第3次在培養(yǎng)箱中孵30 min。對AP側(cè)到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運：AP側(cè)加含藥的HBSS緩沖液200μL，作為給藥側(cè)，BL側(cè)加入空白HBSS緩沖液1 000μL，作為接收側(cè)；對于BL側(cè)到AP側(cè)的轉(zhuǎn)運：BL側(cè)加入含藥的 HBSS緩沖液1 000μL，作為給藥側(cè)，AP側(cè)加入空白HBSS緩沖液200μL，作為接收側(cè)。給藥后將培養(yǎng)板置于37℃恒溫振蕩儀孵育，分別于30、60、90和120 min在接受側(cè)收取溶液100μL，取樣后同時加入空白預(yù)熱的HBSS液100μL。試驗結(jié)束后收集兩側(cè)溶液，計算回收率。

2.6 數(shù)據(jù)的計算與處理

2.6.1 表觀通透系數(shù)（Papp）的計算

dQ／dt為單位時間內(nèi)藥物通過Caco-2細(xì)胞單層的轉(zhuǎn)運量，以藥物的累積轉(zhuǎn)運量（Q）對取樣時間（t）作圖后，該直線的斜率為 dQ／dt；A為小室的膜面積，0.3 cm2；C0為給藥測藥物的初始濃度。

2.6.2 藥物外排率的計算

若藥物的ER大于2，說明藥物的吸收過程可能有外排轉(zhuǎn)運體參與。

2.6.3 回收率的計算［10］

計算公式中Mr-120是接受側(cè)120 min時藥物的累積轉(zhuǎn)運量，包括取出樣品中的藥物量，Md-120給藥側(cè)剩余藥量，Md-0實驗開始時給藥側(cè)的總藥量。

2.6.4 統(tǒng)計分析 所有實驗數(shù)據(jù)以ˉx±s表示。采用兩獨立樣本的雙側(cè)t檢驗對兩組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析對多組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001表明差異有顯著性意義。

3 結(jié) 果

3.1 水飛薊賓HBSS緩沖液中方法學(xué)驗證

特異性：在本試驗的LC-MS／MS條件下，水飛薊賓的出峰時間為1.80 min，內(nèi)標(biāo)氯唑沙宗的出峰時間為1.83 min?？瞻讟颖尽⑺w薊賓以及內(nèi)標(biāo)的特異性色譜圖見圖2。

殘留效應(yīng)：在高濃度樣本ULOQ進樣分析后，接著分析空白樣本，本方法未觀察到殘留效應(yīng)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限：按“2.1.3”和“2.1.4”步驟處理標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品并同時制備空白樣本及含內(nèi)標(biāo)的空白樣本，進行LC-MS／MS分析。以待測物峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f（f＝As／Ai），對待測物濃度c作權(quán)重回歸計算，選1／c2為權(quán)重因子得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，水飛薊賓：y＝0.012 5x＋0.006 29，r＝0.996 6（n＝8）。表明水飛薊賓在 1～1 500 ng／mL內(nèi)線性關(guān)系良好。水飛薊賓LLOQ為 1 ng／mL，準(zhǔn)確度為 83.7% ～118.0%，RSD為13.8%。

稀釋效應(yīng)：考察了超限樣品稀釋5，20，50倍，其中 RSD在2.7～5.7%之間，RE在 －5.1% ～－9%。

準(zhǔn)確度和精密度：按“2.2.3”和“2.2.4”步驟處理質(zhì)控樣品，2 d完成3個分析批，批間和批內(nèi)的RE在 －5.6%～2.9%，批間和批內(nèi) RSD在4.1%～14.5%。

水飛薊賓在HBSS緩沖液中的穩(wěn)定性：準(zhǔn)確度在±15%，RSD均小于15%。各項結(jié)果均符合要求FDA生物樣本分析方法學(xué)驗證的要求［11］，表明此檢測方法穩(wěn)定可靠。

3.2 Caco-2細(xì)胞單層的生長過程

倒置顯微鏡下觀察到的Caco-2細(xì)胞單層從接種到小室中的第1天到第21天的生長過程見圖3。到第21天時，Caco-2細(xì)胞基本無間隙，形成緊密連接。

Figure 2 Representative MRM chromatograms of（A）silybin and（B）chlorzoxazone（IS）for（I）blank HBSS buffer and（II）blank sample spiked with silybin，chlorzoxazone.Arrows indicate retention time of silybin and IS

Figure 3 Growth process of Caco-2 cellmonolayermodel after seeding（×100）

3.3 Caco-2細(xì)胞單層形成過程中跨膜電阻值變化

Caco-2細(xì)胞接種到小室后，從第1周到第2周TEER隨著接種的時間逐漸增大，直到第3周時TEER增長極其緩慢，幾乎達到飽和，不再增長。到第21天時TEER已超過350Ω·cm2。TEER值易受多種因素的影響，一般Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)到15～21 d時，達到一個穩(wěn)定值，不同的實驗環(huán)境會得到不同的TEER，有的低至150Ω·cm2，有的高至900Ω·cm2。結(jié)合本實驗中TEER已達穩(wěn)定的趨勢以及熒光黃的Papp呈現(xiàn)低滲透性的特點，表明本實驗中Caco-2細(xì)胞單層模型的致密性良好［12］。

3.4 熒光黃、阿替洛爾和普萘洛爾細(xì)胞單層的滲透性結(jié)果

Caco-2細(xì)胞在小室中培養(yǎng)21 d后，熒光黃（300μmoL／L）、阿替洛爾（50μmoL／L）、普萘洛爾（50μmoL／L）的細(xì)胞單層滲透性結(jié)果見表2。熒光黃的Papp在5.83～7.03×10－10cm／s之間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1×10－7cm／s，表明此孔的緊密連接合格［7］。文獻中報道的阿替諾爾Papp約為2.01×10－7cm／s，普萘洛爾Papp約為 4.19×10－5cm／s［8，13］，本研究所得的阿替洛爾的Papp遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于普萘洛爾，并且兩者的Papp與文獻中報道相接近。結(jié)果表明本實驗成功建立了Caco-2細(xì)胞單層模型。

Table 1 Change of TEER value during Caco-2 cellmonolayer formation

Table 1 Change of TEER value during Caco-2 cellmonolayer formation

TEER：Transepithelial eletrical resistance

Time of cultivation／d TEER／（Ω·cm2）11.5±3.12 3 25.3±1.25 7 168.1±3.30 12 335.4±4.25 1 21 366.4±7.67

Table 2 P app value of lucifer yellow and positive control drugsn＝3）

Table 2 P app value of lucifer yellow and positive control drugsn＝3）

AP：Apical；BL：Basal

Group Direction：AP-BL P appˉx±s Propranolol（50μmoL／L） 15.12×10－6 （13.85±1.53）×10－6 14.28×10－6 12.16×10－6 Atenolol（50μmoL／L） 0.79×10－6 （0.77±0.04）×10－6 0.73×10－6 0.81×10－6 Lucifer yellow（300μmoL／L） 5.88×10－10 （6.25±0.68）×10－10 5.83×10－10 7.03×10－10

3.5 水飛薊賓的最大濃度和溶劑對單層電阻值的影響

在Caco-2細(xì)胞單層的AP側(cè)給予50μg／mL水飛薊賓后，使用跨膜電阻儀檢測細(xì)胞單層的電阻值變化，見表3。TEER變化很小，表明實驗過程中細(xì)胞單層的完整性不受影響。

Table 3 TEER of Caco-2 monolayer was observed after adding50μg／mL silybin in apical side

Table 3 TEER of Caco-2 monolayer was observed after adding50μg／mL silybin in apical side

The time after silybin added to apical side／h TEER／（Ω·cm2）0 366.4±7.67 1 358.2±5.74 2 333.6±3.24 24 354.7±3.15

3.6 水飛薊賓雙向轉(zhuǎn)運結(jié)果

同一濃度水平的藥物，隨著時間的增加，藥物的累積轉(zhuǎn)運量呈線性增加；同一時間點，隨著濃度的增加，藥物的累積轉(zhuǎn)運量也增加，見圖4，說明藥物的轉(zhuǎn)運量具有時間（r＞0.99）和濃度的相關(guān)性。低、中、高3個濃度水平的水飛薊賓和中濃度的水飛薊賓葡甲胺Papp（AP-BL）平均值分別為 2.01×10－6cm／s；2.93×10－6cm／s；3.81×10－6cm／s；2.70×10－6cm／s，Papp（BL-AP）平均值分別為 14.52×10－6cm／s；13.09×10－6cm／s；11.86×10－6cm／s；9.77×10－6cm／s（圖5）。由Papp（AP-BL）大于2×10－6cm／s，可判斷水飛薊賓有良好的通透性［14］，水飛薊賓溶解度低，在BSC系統(tǒng)中為Ⅱ類藥物。結(jié)果顯示ER遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2（圖6），表明水飛薊賓的吸收過程中可能有外排轉(zhuǎn)運體的參與。低濃度組的Papp（AP－BL）與高濃度組的存在顯著性差異（P＜0.05），隨著水飛薊賓濃度的增加ER值有減少的趨勢，可能是由于藥物高濃度時外排轉(zhuǎn)運體被飽和，這一現(xiàn)象與文獻中報道的水飛薊賓為P-gp底物，可抑制P-gp活性的結(jié)論相一致［15］。此外中濃度的水飛薊賓和水飛薊賓葡甲胺的Papp相近，表明水飛薊賓成鹽對于跨膜通透性沒有改變。

Figure 4 Relationship between cumulative transport amount and time of silybin and silybin-N-meglumine（AP-BL）

Figure5 P app valuesof silybin and silybin-N-meglumine（ˉx±s，n＝3）*P＜0.05

Figure 6 Efflux ratio of silybin and silybin-N-meglumine**P＜0.01，***P＜0.001

3.7 Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運回收率的計算

在Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運實驗的最后一個時間點同時取給藥測和接受測的樣品，檢測給藥初始濃度和給藥測濃度，由表4可知平均回收率在80%～94%之間，說明細(xì)胞單層對藥物的吸附和溶劑的蒸發(fā)基本對實驗結(jié)果無影響，實驗中得到的Papp是準(zhǔn)確的［9］。

Table 4 Recovery of in transport in Caco-2 cell

Table 4 Recovery of in transport in Caco-2 cell

M d-120：Residue of silybin at120 min on the administration side；M r-120：Cumulative transportamountof silybin at120 min in receiving side；M d-0：Total amount of silybin at the beginning

Group Direction c／（μg／mL） M d-120／（ng） M r-120／（ng） M d-0／（ng）Recovery／%Silybin AP-BL 5 843±32 19±3 1 020±14 85±3 20 2 928±236 117±13 3812±7 80±6 50 8 597±1 480 365±81 10 700±11 84±13 Silybin-N-meglumine 28 2 590±139 103±9 3 342±6 81±4 Silybin BL-AP 5 4 480±160 144±12 5 100±69 91±3 20 16 880±216 475±7 19 060±37 91±1 50 44 733±2 380 1 062±153 53 500±57 86±4 Silybin-N-meglumine 28 15 340±1 588 372±16 16 710±30 94±9

4 討 論

本實驗在Caco-2模型中初步考察了水飛薊賓吸收機制，為改良已有的上市劑型，增加生物利用度，并同時減少變異提供理論依據(jù)。水飛薊賓雙向轉(zhuǎn)運實驗表明水飛薊賓的跨膜通透性良好，可判斷水飛薊賓在BSC系統(tǒng)中為Ⅱ類藥物，水飛薊賓在胃腸道中的釋放是其吸收過程的重要影響因素，增加水飛薊賓的溶解度和溶出速率，可提高其口服生物利用度。市售的水飛薊賓卵磷脂復(fù)合物的膠囊劑和水飛薊賓成鹽片劑在比格犬體內(nèi)生物利用度實驗的結(jié)果表明膠囊劑和成鹽片劑的絕對生物利用度相比于原料藥均有極大的提高，這與本實驗的結(jié)果相一致。為進一步明確膠囊劑與成鹽片劑提高口服生物利用度的程度不同的原因，還需通過體外溶出實驗考察藥物磷脂復(fù)合物的形成、成鹽、晶型、減小粒徑對藥物釋放的影響。此外，Caco-2細(xì)胞模型在研究由轉(zhuǎn)運體參與和細(xì)胞旁介導(dǎo)的吸收時有其局限性［16］，在本實驗中發(fā)現(xiàn)可能有外排轉(zhuǎn)運體參與水飛薊賓的吸收，因此除了Caco-2細(xì)胞模型外還需使用其他方法來進一步研究水飛薊賓的吸收機制。

［1］ Bijak，M.Silybin，a major bioactive component of milk thistle（silybum marianum l．gaernt.）-chemitry，bioavailability，and metabolism［J］.Molecules，2017，22（11）：1942.

［2］ Chu Y，LiW，Han JP，et al.Study on pharmacokinetics of silibinin capsule in Chinese healthy volunteers［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25（12）：1669－1672.

［3］ Javed S，Kohli K，Ali M.Reassessing bioavailability of silymarin［J］.Altern Med Rev，2011，16（3）：239－249.

［4］ Xu D，Ni R，Sun W，et al．In vivoabsorption comparison of nanotechnology based silybin A tablets with its water-soluble derivative［J］.Drug Dev Ind Pharm，2015，41（4）：552－559.

［5］ Yang QX，Ma FJ，Zhang LL，et al．Absorption characteristics of silybin-phospholipid complex by rat intestine［J］.Acad JSecond Military Med Univ，2009，30（11）：1288－1291.

［6］ Luan LB，Zhan N.The absorption characteristics of silybinin small intestine of rat［J］.Acta Pharm Sin，2006，41（2）：138－141.

［7］ Wang Y，Zhang D，Liu Z，et al．In vitroandin vivoevaluation of silybin A nanosuspensions for oral and intravenous delivery［J］.Nanotechnology，2010，21（15）：155－168.

［8］ SmetanováL，?tětinováV，Svoboda Z，et al.Caco-2 cells，biopharmacrutics classification system（BCS）and biowaiver［J］.Acta Medica（Hradec Králové），2011，54（1）：3－8.

［9］ Wuyts B，Riethorst D，Brouwers J，etal.Evaluation of fasted state human intestinal fluid as apical solvent system in the Caco-2 absorption model and comparison with FaSSIF［J］.Eur J Pharm Sci，2015（67）：126－135.

［10］ Waterbeemd H，Lennern?s H，Artursson P.Drug Bioavailability（藥物生物利用度）［M］.Beijing：Beijing Chemical Industry Press，2007：82.

［11］FDA.Guidance for industry bioanalyticalmethod validation［S］.2013：1－11.

［12］Srinivasan B，KolliAR，Esch MB，etal．TEERmeasurement techniques forin vitrobarriermodel systems［J］.Jala JLab Autom，2015，20（2）：107－126.

［13］Artursson P.Epithelial transport of drugs in cell culture I：amodel for studying the passive diffusion of drugs over intestinal absorbtive（Caco-2）cells［J］.JPharm Sci-US，1990，79（6）：476－482.

［14］Artursson P，Palm K，Luthman K.Caco-2 monolayers in experimental and theoretical predictions of drug transport［J］.Adv Drug Deliver Rev，2001，46（1／2／3）：27－43.

［15］Tan ZR，Zhou YX，Liu J，et al．The influence of ABCB1 polymorphism C3435T on the pharmacokinetics of silybinin［J］.J Clin Pharm Ther，2015，40（6）：685－688.

［16］Krishna R，Yu L.Biopharmaceutics Applications in Drug Development（生物藥劑學(xué)在藥物研發(fā)中的應(yīng)用）［M］.Beijing：Peking University Medical Press，2012：36.