王佳祺，陳 姣，孫曉艷，盧悟廣，楊 洋，蔡雪婷，王小寧，曹 鵬*

（1南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，南京210028；2江蘇省中醫(yī)藥研究院細(xì)胞與分子生物學(xué)實驗室，南京210028）

蛋白激酶作為驅(qū)動子，在腫瘤細(xì)胞的生長、存活和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，參與了人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。許多與腫瘤相關(guān)的蛋白激酶也成為了藥物設(shè)計的有效靶點。多種蛋白激酶抑制劑類抗腫瘤藥物能夠通過抑制蛋白激酶的活性從而有效限制腫瘤的發(fā)展。但仍有報道多種蛋白激酶抑制劑出現(xiàn)藥物耐受現(xiàn)象，故尋找新的藥物靶點、開發(fā)新型蛋白激酶抑制劑類藥物顯得尤為重要。p21活化的蛋白激酶（p21-activated kinases，PAKs）屬于進化保守的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶家族，是小分子GTP酶Cdc42和Rac1下游的效應(yīng)子。PAKs位于多條腫瘤形成相關(guān)信號通路的交匯處，被突變或上游效應(yīng)子激活的PAKs能夠促進細(xì)胞的增殖、存活、侵襲及轉(zhuǎn)移。同時，PAKs在多種惡性腫瘤中活化并發(fā)揮重要作用［1］。PAKs結(jié)構(gòu)上主要包含高度同源的C端激酶催化區(qū)域和存在差異的N端調(diào)節(jié)區(qū)域。根據(jù)結(jié)構(gòu)和活化方式的異同，PAK家族被分為兩個亞群：亞群Ⅰ（PAK1-3）和亞群Ⅱ（PAK4-6）［2］。PAKs各種亞型分布于不同組織且在腫瘤的病理過程中具有不可取代的作用。其中，PAK1是最有特點的一個亞型，在傳遞胞外信號、調(diào)節(jié)細(xì)胞運動性方面發(fā)揮著重要作用［3－4］。PAK1廣泛表達于腦、肌肉及脾臟等組織中，同時其在多種惡性腫瘤中表達顯著增高，如卵巢癌、乳腺癌和膀胱癌［5－7］。研究表明，PAK1通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、侵襲和轉(zhuǎn)移，影響著多種惡性腫瘤的形成以及癌前病變過程［8－10］。因此，PAK1被認(rèn)為是重要的腫瘤治療靶點之一，篩選開發(fā)PAK1抑制劑作為腫瘤靶向治療藥物具有重要意義。

傳統(tǒng)的PAK1抑制劑篩選主要是通過人工篩選和高通量篩選的方法，兩種方法各有其優(yōu)缺點。前者耗時耗力且人為操作誤差較大，后者雖可采用自動化的操作系統(tǒng)進行大規(guī)模的化合物篩選，但需要的靶酶或靶細(xì)胞較多且陽性率低，因此成本高、效率低。隨著計算機技術(shù)的發(fā)展和大數(shù)據(jù)分析的出現(xiàn)，應(yīng)用虛擬篩選方法發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物就逐漸成為主流?；诜肿訉拥挠嬎銠C輔助藥物篩選方法（computer-aided drug screening，CADD）是通過受體與化合物之間的空間匹配和能量匹配從大量有機化合物中遴選出可能的有效候選化合物，以便后續(xù)實驗驗證。這種方法避免了對化合物的盲目篩選，大大降低發(fā)現(xiàn)活性先導(dǎo)化合物的成本，縮短了藥物研發(fā)周期，是目前較為常用的一種藥物篩選模式［11］。本實驗通過分子對接的虛擬篩選方法，根據(jù)化合物與PAK1結(jié)合的打分篩選出可能的有效候選化合物，進一步通過高通量Z′lyteTM激酶檢測和腫瘤細(xì)胞殺傷活性檢測篩選出一種新型PAK1小分子抑制劑——K788。

1 材 料

1.1 細(xì)胞株

人原位胰腺腺癌細(xì)胞株（BxPC-3）、人胰腺癌細(xì)胞（PANC-1）、人肺癌細(xì)胞株（A549、H1975、PC9），人結(jié)腸癌細(xì)胞株（DLD-1）購于上海中科院細(xì)胞庫。

1.2 試 劑

PAK1抑制劑陽性藥 IPA-3（美國 Selleck?公司），溶于 DMSO中制成濃度為20 mmol／L的母液，貯存于－20℃冰箱，稀釋后用于實驗；人重組蛋白激酶PAK1（美國AdooQ Bioscience公司）；MTT（美國Sigma公司）；Z′lyteTM激酶檢測試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）；RMPI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胰酶（0.25%Trypsin-EDTA）、胎牛血清、青霉素加鏈霉素（美國Gibco公司）。凋亡檢測試劑盒PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I（美國BD Pharmingen公司）。

1.3 儀器和軟件

Multiskan全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific公司）；Axio observer A1倒置熒光顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）；CKX41倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Odyssey近紅外激光成像儀（美國Li-COR公司）；PowerPACTM凝膠電泳儀（美國Bio-Rad公司）；FACSAriaⅡ流式細(xì)胞儀（美國BD Pharmingen公司）；曙光 TC6600，Schrodinger（2015-3）軟件，PDB數(shù)據(jù)庫（ID：4EQC和 4ZJJ），ChemDiv多樣性小分子數(shù)據(jù)庫。

2 方 法

2.1 計算機輔助篩選PAK1靶向的候選藥物

目前針對PAK1研究的小分子抑制劑主要分為ATP競爭型和別構(gòu)型。ATP競爭型抑制劑在PAK1結(jié)構(gòu)的催化中心處與ATP競爭性結(jié)合，從而抑制PAK1的活化。而別構(gòu)調(diào)節(jié)型抑制劑可以通過結(jié)合到PAK1結(jié)構(gòu)中ATP口袋鄰近的區(qū)域或PAK1背面的結(jié)合口袋，引起PAK1構(gòu)象的變化干擾其活化［12］。兩種類型的抑制劑對PAK1均有較好的抑制效果，因此本實驗對兩種作用模式的抑制劑均進行了篩選。計算機篩選流程圖如圖1所示。

Figure 1 Overall drug screening processHTVS：High throughput screening；SP：Standard precision screening；XP：Extra precision screening

首先，本研究以 PAK1與競爭性抑制劑FRAX597結(jié)合的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)（PDB∶4EQC）和PAK1與別構(gòu)調(diào)節(jié)抑制劑ABAMECTIN結(jié)合的復(fù)合物結(jié)構(gòu)（PDB：4ZJJ），采用 Schrodinger（2015-3）軟件對蛋白結(jié)構(gòu)進行預(yù)處理。去除水分子，加氫，在pH 7.4下優(yōu)化氫鍵，使用OPLS3力場對蛋白進行限制性能量優(yōu)化，使重原子的RMSD收斂于0.3?。以晶體結(jié)構(gòu)中的原有配體所在位點為中心，定義周圍15?范圍為活性口袋生成格點文件。然后，候選化合物庫被進行成藥性過濾（濾除相對分子質(zhì)量大于600、小于200且環(huán)數(shù)大于10、可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)大于10的分子），在pH＝7.0±2.0下采用Epik方法對ChemDiv數(shù)據(jù)庫進行質(zhì)子化，使用OPLS3力場對數(shù)據(jù)庫分子進行構(gòu)象生成，保持分子原有手性特征，每個分子最多產(chǎn)生32個構(gòu)象。所有候選化合物的虛擬篩選使用Glide模塊逐級篩選方法，算法精度依次升高：高通量篩選模式（HTVS）→標(biāo)準(zhǔn)精度篩選模式（SP）→超高精度篩選模式（XP），每步篩選保留10%的分子，通過結(jié)合能及結(jié)合模式分析，對競爭性和別構(gòu)調(diào)節(jié)抑制劑各選20個候選化合物進行活性驗證。

2.2 Z′lyteTM激酶檢測候選化合物的PAK1激酶抑制活性

將底物與酶溶液預(yù)先混合孵育10 min，加入候選化合物（終濃度10μmol／L）后輕輕混勻，于30℃反應(yīng)振蕩反應(yīng)1 h。然后加入Development Reagent并輕輕混勻，室溫孵育1 h。時間點到后繼續(xù)加入Stop Reagent終止酶反應(yīng)，于酶標(biāo)儀上檢測445 nm／520 nm處發(fā)射光值，并計算發(fā)射光比值E445／520；試劑盒中底物兩端被香豆素和熒光素標(biāo)記，酶有活性時可催化底物發(fā)生磷酸化，不會被Development Reagent切割。在激發(fā)光的作用下香豆素和熒光素會發(fā)生熒光共軛能量轉(zhuǎn)移，發(fā)射光比值改變。酶活被抑制時則發(fā)射光比值不變，基于發(fā)射光比值的變化來計算化合物對酶活抑制率。酶活抑制率見公式（1）：

其中：C100%表示香豆素100%磷酸化對照孔發(fā)射光強度均值；C0%表示香豆素0%磷酸化對照孔發(fā)射光強度均值；F100%表示熒光素100%磷酸化對照孔發(fā)射光強度均值；F0%表示熒光素0%磷酸化對照孔發(fā)射光強度均值。

2.3 MTT法檢測候選化合物對腫瘤細(xì)胞抑制活性

MTT法用于檢測不同候選藥物對 BxPC-3、PANC-1、A549 3種細(xì)胞的增殖抑制作用。取對數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔5×103個細(xì)胞的密度接種于96孔板中。各候選化合物按照預(yù)設(shè)的藥物濃度加藥，各組設(shè)置3個復(fù)孔，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。藥物處理時間結(jié)束后，每孔加入濃度為5 g／L的MTT 10μL，37℃培養(yǎng)箱孵育4 h后，吸取上清液，每孔加入DMSO 100μL于振蕩器上溶解10 min，測定A570／630并計算增殖抑制率。增殖抑制率計算見公式（2）：

2.4 Western blot法檢測 K788對腫瘤細(xì)胞中PAK1及pPAK1表達水平的影響

取對數(shù)生長期的結(jié)直腸癌細(xì)胞株DLD-1，肺癌細(xì)胞株A549、H1975和PC-9，胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1和BxPC-3，以每毫升2×105個細(xì)胞的密度種入6孔板后于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞長到80%融合度后分別加入不同濃度的K788（0，5，10，20，30μmol／L）處理24 h，在冰上用 RIPA裂解細(xì)胞30 min提取全蛋白，加入Sample buffer用煮樣器煮沸3 min后上樣進行SDS-PAGE，再70 V轉(zhuǎn)膜1 h，用5%脫脂牛奶封閉2 h后，孵育一抗（1∶1 000稀釋）于4℃孵育過夜，用 TBST（含0.1%吐溫-20）漂洗4遍（間隔 10 min）后二抗（1∶10 000稀釋）孵育1 h，經(jīng) TBST漂洗4遍后于ECL曝光顯影，曝光 PAK1、p-PAK1、AKT、p-AKT、Cleaved-PARP、Caspase 3、Bcl-2、BAX等目的條帶。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測K788誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的DLD-1細(xì)胞，以每毫升1×105個的密度種入6孔板后于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞長到80%匯合程度后分別加入不同濃度的 K788（0，10，20，40μmol／L）處理24 h。到達時間點后用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次（2 000 r／min離心5 min）收集1×105個細(xì)胞；加入Binding Buffer懸浮細(xì)胞100μL；加入 Annexin V-PE 5μL混勻后，加入7-AAD 5μL，混勻。室溫、避光、反應(yīng)15 min后，用流式細(xì)胞儀檢測。

3 結(jié) 果

3.1 計算機輔助模擬篩選PAK1靶向候選化合物

根據(jù)對接打分、結(jié)合模式以及結(jié)構(gòu)多樣性分析，本實驗篩選出27個ATP競爭型候選化合物（圖2）和14個別構(gòu)調(diào)節(jié)型候選化合物（圖3），用于后續(xù)活性驗證實驗。

Figure 2 ATP competitive candidate compounds

Figure 3 Allosteric candidate compounds

3.2 候選化合物對PAK1激酶的抑制作用

基于計算機輔助篩選的結(jié)果，本實驗最終確定41個候選化合物。為探究候選化合物在體外酶反應(yīng)體系中對酶活性的抑制效果，采用Z′lyte高通量激酶檢測試劑盒對候選化合物的PAK1激酶抑制活性進行檢測。選取PAK1別構(gòu)調(diào)節(jié)型抑制劑IPA-3作為陽性對照，各化合物初篩濃度為10 μmol／L。如圖4所示，41個候選化合物中有16個化合物對PAK1酶活抑制率高于10%，其中，化合物2、5、7、19的酶活抑制率大于40%。

Figure 4 Inhibitory effect of candidate compounds on enzyme activity in vitro

3.3 候選化合物對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用

為了驗證候選PAK1抑制劑對腫瘤細(xì)胞的作用，本實驗采用MTT法檢測細(xì)胞活性來進一步評估上述16種對PAK1酶活抑制較好的候選化合物對PAK1陽性腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。本實驗選取PAK1高表達的胰腺癌細(xì)胞株（BxPC-3和PANC-1）和PAK1高度活化的肺癌細(xì)胞株A549。將藥物設(shè)置50和100μmol／L兩個濃度，于BxPC-3細(xì)胞上進行初篩，作用24 h，結(jié)果如圖5-A所示，結(jié)果顯示，16種化合物不同程度的抑制BxPC-3的增殖，其中化合物3、5、17、18和40在100μmol／L時的增殖抑制率都超過了80%，化合物3、5和18在50μmol／L時的抑制率也超過了80%。而陽性藥IPA-3在50μmol／L時的抑制率已經(jīng)超過80%。

如圖5-B和5-C所示?；衔?和化合物3在25μmol／L對PANC-1和A549細(xì)胞的增殖抑制率低于40%，化合物6對PANC-1細(xì)胞更敏感，25 μmol／L時抑制率達到50%，而對A549細(xì)胞無明顯抑制效果。化合物18在25μmol／L時對兩種細(xì)胞的抑制率都高于80%，且在相同濃度下對PANC-1和A549細(xì)胞的抑制效果均好于陽性藥IPA-3。其余化合物在兩個高低濃度對細(xì)胞的增殖抑制率都低于40%。綜合3種腫瘤細(xì)胞的篩選結(jié)果來看，化合物17對胰腺癌細(xì)胞BxPC-3和PANC-1的抑制效果較好，而化合物18對3種細(xì)胞都有較好的抑制效果，更具有后續(xù)研究的價值。

Figure 5 Effect of candidate compounds on proliferation inhibition of cancer cells.（A）Inhibiton effect of candidate compounds on BxPC-3 at50 and 100μmol／L.（B）Inhibiton effectof compounds No.2，3，5，17，18，24 and 40 on PANC-1 at10μmol／L and 25 μmol／L，concentration of the rest compounds are 25 and 50μmol／L.（C）Inhibiton effect of compounds No.2，3，5，17，18，24 and 40 on PANC-1 at10 and 25μmol／L，concentration of the rest compounds are at25 and 50μmol／L

3.4 K788與PAK1激酶相互作用的模式預(yù)測

通過體外酶活性水平和對細(xì)胞抑制作用的驗證篩選，本實驗找到1個活性較好的候選PAK1抑制劑（化合物18，K788）。為了更好地了解這個化合物發(fā)揮作用的方式，對化合物和靶蛋白PAK1的相互作用模式進行分析，結(jié)果如圖6所示?；衔颣788與PAK1的作用位點在ATP結(jié)合口袋的背面（圖6-A），在此位點結(jié)合能夠使PAK1發(fā)生別構(gòu)，導(dǎo)致其酶活性受到抑制。K788與PAK1之間的相互作用力主要為疏水作用和氫鍵作用。K788結(jié)構(gòu)中的季胺基團與Glu315形成氫鍵，兩個苯環(huán)和環(huán)己烷深入到PAK1的疏水性口袋中（圖6-B）。這些分子間作用力使得抑制劑與靶蛋白結(jié)合更加牢固，從而抑制PAK1的活化。

3.5 K788對PAK1陽性腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用

進一步檢測K788對6株P(guān)AK1表達陽性的腫瘤細(xì)胞中PAK1表達及活化水平的影響，結(jié)果如圖7-A和7-B所示，PAK1在DLD-1細(xì)胞中表達和活化相對較高，而A549細(xì)胞中PAK1的表達量相對較低但活化程度最高。體外細(xì)胞毒性實驗表明化合物K788對PAK1相對高度活化及高表達的肺癌細(xì)胞株A549（圖7-C）和結(jié)直腸癌DLD-1細(xì)胞（圖7-D）有較好的抑制活性，且抑制活性均高于陽性藥IPA-3?；衔颣788對DLD-1細(xì)胞更為敏感，加藥24 h的細(xì)胞抑制IC50為9.39μmol／L，加藥后24 h細(xì)胞開始發(fā)生皺縮死亡，胞內(nèi)有類似凋亡小體樣空泡出現(xiàn)，可能是藥物誘導(dǎo)DLD-1細(xì)胞發(fā)生凋亡（圖7-E）。

3.6 K788通過調(diào)控 PAK1／AKT／Bcl-2通路誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞DLD-1凋亡

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測K788誘導(dǎo)DLD-1細(xì)胞凋亡活性，并進一步利用Western blot技術(shù)檢測K788對胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達水平的影響。流式細(xì)胞儀統(tǒng)計結(jié)果表明：化合物K788在10μmol／L濃度加藥8 h后，PE＋／7-AAD－細(xì)胞增多，即細(xì)胞開始發(fā)生凋亡。綜合分析發(fā)現(xiàn)K788能劑量依賴性促進DLD-1細(xì)胞凋亡。同時Western blot結(jié)果表明，K788通過降低 PAK1磷酸化水平以降低PI3K／AKT／Bcl-2信號通路中AKT的活性，導(dǎo)致抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少、促凋亡蛋白BAX表達增加，激活caspase凋亡通路，引起細(xì)胞凋亡［14］。

Figure 6 Interaction models between candidate inhibitor K788 and PAK1A：View of the specific PAK1 binding sites in complex with CP734；B：Overall structure of PAK1 with CP734 bound in the ATP banding site

Figure 7 Inhibitory activity of compound K788 on cancer cells proliferation（n＝3）.（A）Expression level of PAK1 and phospho-PAK1（active form）in several cancer cells detected byWestern Blotting.（B）Relative expressions level of PAK1，phospho-PAK1 and phospho-PAK1／PAK1 normalized toβ-actin.（C）Inhibition curve of K788 and IPA-3 on A549 at indicated concentrations for 24 h.（D）Inhibition curve of K788 and IPA-3 on DLD-1 at indicated concentrations for 24 h.（E）Photograph of DLD-1 cells on drug treatment after 24 h

Figure 8 Compound K788 induces apoptosis of DLD-1 by regulating AKT／Bcl-2 signaling.（A）Induction of apoptosis by K788 treatment for24 h in DLD-1 in vitro analyzed by flowcytometry.（B）Percentage of apoptosis cells of DLD-1.**P＜0.01；***P＜0.001 vs control group.（C）Western blot analysis of PAK1，AKT and apoptosis-associated proteins

4 討 論

ATP競爭型PAK1抑制劑主要有羥吲哚／順丁烯二酰亞胺類、吡咯并吡唑類、單環(huán)氨基吡唑類、氮雜吲哚聯(lián)芳基酮類、苯并咪唑類抑制劑；別構(gòu)調(diào)節(jié)型抑制劑主要有二苯并二氮?類，活性較好的PAK1抑制劑為諾華公司研發(fā)的二苯并二氮?類化合物30和IPA-3［12］。盡管如此，目前，針對PAK的靶向抑制劑還沒有成藥上市，唯一進入臨床試驗的是輝瑞公司的ATP競爭型抑制PF-3758309［13］，所以新型PAK抑制劑的發(fā)現(xiàn)就顯得尤為重要?，F(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的PAK1抑制劑大多為ATP競爭型，其活性雖好但選擇性較差，進入人體內(nèi)很可能產(chǎn)生較大的不良反應(yīng)，因此別構(gòu)調(diào)節(jié)型相對于ATP競爭型在選擇性上更有優(yōu)勢。

傳統(tǒng)先導(dǎo)化合物篩選的方法存在盲目、成本高和效率低等問題。與傳統(tǒng)篩選方法相比，虛擬篩選可以富集活性化合物，大大降低篩選的成本，提高藥物篩選的可能性［12］。本研究中，正是借助計算機輔助虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)了一種新型新型PAK1抑制劑K788。

本實驗通過計算機輔助篩選出化合物K788，其體外酶活的抑制率為42.7%，稍遜于別構(gòu)調(diào)節(jié)型PAK1抑制劑IPA-3。但對于PAK1高表達以及高度活化的細(xì)胞株DLD-1和A549，K788則顯示出更強的抑制活性。其對于DLD-1和A549細(xì)胞增殖抑制的 IC50分別為（9.39±0.023）μmol／L和（13.04±0.026 9）μmol／L，顯著高于 IPA-3（IC50＝26.27±0.065 9μmol／L）。此外，K788能顯著抑制PAK1的磷酸化從而下調(diào)PI3K信號通路下游AKT的活性，從而激活caspase凋亡通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

本研究表明，計算機輔助虛擬篩選是一種高效快速的激酶篩選技術(shù)體系，能夠廣泛應(yīng)用于靶向藥物的篩選和鑒定。同時篩選出的新型PAK1小分子抑制劑K788具有臨床開發(fā)應(yīng)用的巨大潛力。

［1］ Radu M，Semenova G，Kosoff R，et al．PAK signalling during the development and progression of cancer［J］.Nat Rev Cancer，2014，14（1）：13－25.

［2］ Kumar R，Vadlamudi RK.Emerging functions of p21-activated kinases in human cancer cells［J］.JCell Physiol，2002，193（2）：133－144.

［3］ Sells MA，Knaus UG，Bagrodia S，et al．Human p21-activated kinase（PAK1）regulates actin organization in mammalian cells［J］.Curr Biol，1997，7（3）：202－210.

［4］ Delorme V，Machacek M，Dermardirossian C，et al．Cofilin activity downstream ofPak1 regulates cell protrusion efficiency by organizing lamellipodium and lamella actin networks［J］.Dev Cell，2007，13（5）：646－662.

［5］ Balasenthil S，Sahin AA，Barnes CJ，et al．P21-activated kinase-1 signalingmediates cyclin D1 expression in mammary epithelial and cancer cells［J］.JBiol Chem，2004，279（2）：1422－1428.

［6］ Schraml P，Schwerdtfeger G，Burkhalter F，et al．Combined array comparative genomic hybridization and tissuemicroarray analysis suggest PAK1 at 11q13.5-q14 as a critical oncogene target in ovarian carcinoma［J］.Am JPathol，2003，163（3）：985－992.

［7］ Ito M，Nishiyama H，Kawanishi H，et al．P21-activated kinase 1：a new molecularmarker for intravesical recurrence after transurethral resection of bladder cancer［J］.JUrol，2007，178（3）：1073－1079.

［8］ Vadlamudi RK，Adam L，Wang RA，et al．Regulatable expression of p21-activated kinase-1 promotes anchorage-independentgrowth and abnormal organization ofmitotic spindles in human epithelial breast cancer cells［J］.J Biol Chem，2000，275（46）：36238－36244.

［9］ Wang RA，Zhang H，Balasenthil S，et al．PAK1 hyperactivation is sufficient for mammary gland tumor formation［J］.Oncogene，2006，25（20）：2931－2936.

［10］Dummler B，Ohshiro K，Kumar R，et al．Pak protein kinases and their role in cancer［J］.Cancer MetastRev，2009，28（1／2）：51－63.

［11］Sala-Vila A，F(xiàn)olkes J，Calder PC.The effect of three lipid emulsions differing in fatty acid composition on growth，apoptosis and cell cycle arrest in the HT-29 colorectal cancer cell line［J］.Clin Nutr，2010，29（4）：519－524.

［12］Rudolph J，Crawford JJ，Hoeflich KP，et al．Inhibitors of p21-activated kinases（PAKs）［J］.JMed Chem，2015，58（1）：111.

［13］Ndubaku CO，Crawford JJ，Drobnick，J，et al．Design of selective PAK1 inhibitor G-5555：improving properties by employing an unorthodox low-pKa polarmoiety［J］.ACSMed Chem Lett，2015，6（12）：1241－1246.

［14］Beck JT，Ismail A，Tolomeo C.Targeting the phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）／AKT／mammalian target of rapamycin（mTOR）pathway：an emerging treatment strategy for squamous cell lung carcinoma［J］.Cancer Treat Rev，2014，40（8）：980－989.