王依婷，趙夢鴿，盛雪萍，張 健，蔣翠花*，殷志琦

（1中國藥科大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室＆天然藥物活性組分與藥效國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009；2南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，南京210028；3江蘇省中醫(yī)藥研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，南京210028）

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes，T2DM）是一種以高血糖為特征的慢性代謝性疾病，可引發(fā)腎功能衰竭、心臟病發(fā)作、失明、下肢壞疽等并發(fā)癥［1］。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新報(bào)告統(tǒng)計(jì)，2014年全球約有4.22億糖尿病患者，其中T2DM患者超過90%［2］。“雙激素異常假說”認(rèn)為糖尿病的主要病因不僅是胰島素不足，也與胰高血糖素的相對或絕對過多有關(guān)［3－4］。而胰高血糖素分泌過多的原因之一是α細(xì)胞的胰島素抵抗。在高糖、炎癥等持續(xù)刺激下，胰島α細(xì)胞可能會(huì)產(chǎn)生原發(fā)性的胰島素抵抗，胰島素受體-1（IRS-1）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）及其胰島素信號(hào)通路中下游蛋白激酶B（Akt）的表達(dá)明顯降低，與此同時(shí)外源性胰島素對胰高血糖素分泌的抑制作用明顯減弱，胰高血糖素分泌異常增加，引起血糖急劇上升［5－7］。因此通過干預(yù)IRS-1／PI3K／Akt信號(hào)通路改善α細(xì)胞胰島素抵抗可能是治療T2DM的有效途徑之一。

青錢柳（Cyclocarya paliurus）為胡桃科青錢柳屬植物，是我國特有物種［8］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，青錢柳具有降血糖、降血脂等功效［9－12］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳葉富含三萜酸部位可通過影響小鼠脂肪組織中IRS-1／PI3K／Akt信號(hào)通路傳導(dǎo)而改善胰島素抵抗，其對胰島α細(xì)胞胰島素抵抗是否具有調(diào)節(jié)作用有待研究［13］。本文擬采用高糖誘導(dǎo)小鼠胰高糖素瘤細(xì)胞株（αTC1-6）建立胰島素抵抗細(xì)胞模型，探究青錢柳三萜酸對胰島α細(xì)胞胰高血糖素分泌的影響及其可能的干預(yù)機(jī)制［14］。

1 材 料

1.1 試 劑

DMEM培養(yǎng)基（低糖）、HEPES［4-（2-羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸］、雙抗（青霉素和鏈霉素）、MEM非必需氨基酸（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國ScienCell公司）；胰蛋白酶-EDTA消化液、噻唑蘭MTT、PBS溶液（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；二甲基亞砜DMSO、RIPA裂解液、PMSF、渥曼青霉素、Anti-Glucagon antibody（美國Cell Signaling Technology公司）；KRBH緩沖液（廣州沛瑜生物制品有限公司）；胰島素（美國 Sigma公司）；Trizol Reagent（美國Life Technologies公司）；葡萄糖檢測試劑盒（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司）；胰高血糖素ELISA試劑盒（美國R＆D公司）；引物、DEPC水（上海捷瑞生物工程有限公司）；SYBR Green Realtime PCR Master Mix、ReverTra Ace qPCR RTMaster Mix with gDNA Remover［東洋紡（上海）生物科技有限公司］；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

倒置熒光顯微鏡（德國 Carl Zeiss公司）；Microfuge 22R臺(tái)式微量冷凍離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）；恒溫干燥箱Synergy H1多功能酶標(biāo)儀（美國 Biotek公司）；QuantStudio?Dx Real-Time PCR循環(huán)儀；S1000 PCR熱循環(huán)儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 藥 物

青錢柳采自南京林業(yè)大學(xué)（GPS坐標(biāo)：N32°04′46.95″，E118°48′47.40″），由中國藥科大學(xué)中藥資源與開發(fā)教研室秦民堅(jiān)教授鑒定為Cyclocarya paliurus（Batal）Iljinskaja。樣本保存于中國藥科大學(xué)天然藥化教研室（No.L20100033）。取青錢柳干燥粉末2.5 kg用80%乙醇回流提?。?0 L×3，每次2 h）。合并提取物，減壓濃縮無醇味后加適量水混懸，用石油醚脫脂并用氯仿分離，得到氯仿部位提取物171.9 g。取部分氯仿提取物用3%NaOH水溶液提取后，水相部分用5%HCl溶液反復(fù)萃取3次，得到三萜酸富集部位84.7 g（得率為3.39%）。

1.4 細(xì)胞株

小鼠胰高糖素瘤細(xì)胞株αTC1-6，購買自美國ATCC細(xì)胞庫。

2 方 法

2.1 細(xì)胞胰島素抵抗模型建立

2.1.1 高糖對αTC1-6細(xì)胞毒性的影響 將對數(shù)生長期αTC1-6細(xì)胞消化后，以每孔7.5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后將含有11 mmol／L葡萄糖的培養(yǎng)基換成含有 5.5、25、30和33 mmol／L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)1、3、5和7 d后，每孔加入5 mg／mLMTT 20μL，孵育4 h，吸去上清液，每孔加入DMSO溶液150μL，振蕩10 min，570 nm處測定吸收度（A）。

2.2.2 高糖對αTC1-6細(xì)胞胰高血糖素分泌的影響 取對數(shù)生長期αTC1-6細(xì)胞，以每毫升2.5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于12孔板中，細(xì)胞貼壁后分別給予含有5.5、25、30和33 mmol／L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)1、3、5和 7 d，用 ELISA試劑盒測定上清液中的胰高血糖素含量。

2.3 TAE對αTC1-6細(xì)胞活力的影響

待αTC1-6細(xì)胞生長密度達(dá)到85%～90%時(shí)，按照每孔7.5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)基，加入不完全DMEM培養(yǎng)基（11 mmol／L）和待測藥物，藥物的質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、15、20、25和 30μg／mL。加藥孵育 24 h后，方法同“2.1.1”，測定MTT，計(jì)算細(xì)胞活力。

2.4 TAE對αTC1-6細(xì)胞胰高血糖素分泌的影響

αTC1-6細(xì)胞以每孔5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板，分別給予含5.5，25 mmol／L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，共分為兩大組：加胰島素組（100 nmol／L）和不加胰島素組。每組再分為6組，分別為正常對照組（5.5 mmol／L葡萄糖）、模型組（25 mmol／L葡萄糖）、青錢柳氯仿部位三萜酸組（TAE，1、5、10μg／mL）和 10μg／mL TAE＋PI3K抑制劑渥曼青霉素（10 nmol／L）組。各組用對應(yīng)葡萄糖的濃度DMEM培養(yǎng)5 d后，將培養(yǎng)基換為不含血清的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)加入藥物孵育20 h后，加入胰島素孵育4 h。孵育完成后，吸去上清液，KRBH溶液清洗兩遍，然后用KRBH溶液孵育30 min，吸去上清液，再用含1 mmol／L葡萄糖的KRBH緩沖液（0.5%BSA）孵育1.5 h，留取上清液，于－20℃保存，ELISA試劑盒檢測胰高血糖素含量。同時(shí)抽提各孔細(xì)胞總蛋白，采用BCA定量試劑盒測定蛋白濃度，以校正胰高血糖素濃度。

2.5 Real-time PCR實(shí)驗(yàn)

αTC1-6細(xì)胞按照“2.4”項(xiàng)下方法處理后，PBS液清洗細(xì)胞兩次，用Trizol試劑提取細(xì)胞RNA，酶標(biāo)儀測定A260／280及其濃度。RNA在65℃條件下預(yù)變性5 min后，立即置于冰上，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配制體系，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反映參數(shù)為：37℃，15 min；50℃，5 min；98℃，5 min。按照PCR試劑盒配置反應(yīng)體系后進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)為：95℃，15 s；60℃，15 s；72℃，45 s。其中，95℃預(yù)變性60 s；共循環(huán)40次。測得各基因引物序列見表1。

Table 1 Primer sequence for real-time PCR assay

2.6 Western blot分析

細(xì)胞按照“2.4”項(xiàng)處理后，PBS液清洗細(xì)胞兩次，每孔加蛋白裂解液150μL在冰上裂解5 min，吹打細(xì)胞數(shù)次，收集細(xì)胞，0℃超聲波破碎3次，冰上放置30 min后在－20℃和37℃之間反復(fù)凍融3次，12 000 r／min離心 10 min，收集上清液，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白質(zhì)樣品稀釋至相同且合適的濃度進(jìn)行SDS-PAGE電泳（電泳條件：85 V，20 min；120 V，80 min），然后轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上在5%脫脂奶粉封閉液中室溫封閉1 h，加入一抗（1∶800）4℃過夜，之后加入二抗（1∶2 000）37℃孵育2 h，采用電化學(xué)發(fā)光檢測法（ECL檢測法）顯色，并對感光膠片條帶進(jìn)行灰度值分析。

2.7 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié) 果

3.1 αTC1-6細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立

高濃度葡萄糖培養(yǎng)基分別培養(yǎng)αTC1-6細(xì)胞1、3、5和7 d后，測定不同糖濃度培養(yǎng)下αTC1-6細(xì)胞培養(yǎng)液中胰高血糖素含量。結(jié)果顯示葡萄糖濃度超過25 mmol／L，培養(yǎng)時(shí)間超過5 d時(shí)，胰高血糖素分泌明顯升高（圖1）。其中葡萄糖濃度為25 mmol／L，培養(yǎng)時(shí)間為5 d時(shí)，不僅可以顯著增加胰高血糖素分泌（P＜0.05），且數(shù)據(jù)穩(wěn)定性較好，故采用葡萄糖含量為25 mmol／L的培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d建立αTC1-6細(xì)胞胰島素抵抗模型。

Figure 1 Time-and dose-dependency of glucose-induced glucagon secretion inαTC1-6 cells）*P＜0.05，**P＜0.01 vs5.5 mmol／L for 1 day

3.2 TAE對αTC1-6細(xì)胞活力的影響

如圖 2所示，MTT法檢測 1、2、5、10、15、20、25和30μg／mL青錢柳三萜酸的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對照組相比，質(zhì)量濃度為1、2、5、10和15μg／mL的青錢柳三萜酸細(xì)胞活力明顯大于90%，無細(xì)胞毒性，故選擇 1、5、10μg／mL 3個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。

Figure 2 Effect of triterpenic acid-enriched fraction from Cyclocarya paliurus（TAE）on cell viability ofαTC1-6 cells.αTC1-6 cells were treated with different concentration of TAE for24 h，and then cell viability wasmeasured by MTT assay（ˉx±s，n＝6）*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

3.3 TAE對αTC1-6細(xì)胞胰高血糖素分泌的影響

如圖3所示，與正常對照組相比，高糖模型組胰高血糖分泌量顯著增加（P＜0.05）。與模型組相比，青錢柳三萜酸 1、5和 10μg／mL作用于αTC1-6細(xì)胞模型24 h后，給藥組細(xì)胞的胰高血糖素分泌量明顯降低，并存在濃度依賴性。胰島素條件下，正常對照組和模型組的胰高血糖素分泌量均下降，說明胰島素可以抑制胰高血糖素的分泌。而青錢柳三萜酸各給藥組胰高血糖素顯著下降，說明其可降低胰高血糖分泌且具有一定的胰島素依賴性。

Figure 3 Effect of TAE on glucagon secretion inαTC1-6 cells.αTC1-6 cellswere incubated for5 days in DMEM media containing5.5mmol／L glucose or 25 mmol／L glucose in the presence or absence of different concentration of TAE for24 h with orwithout insulin（100 nmol／L）for 4 h.Wortmannin（10 nmol／L）was added 30 minutes before insulin at the last group＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs contol group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group

3.4 TAE對αTC1-6細(xì)胞中IRS-1、PI3K和Akt磷酸化水平的影響

與正常對照組相比，高糖刺激下模型組的IRS-1、PI3K、Akt含量均降低，符合糖尿病癥狀（圖4）。TAE干預(yù)后，IRS-1、PI3K和 Akt的磷酸化水平較模型組顯著上升，并具有濃度依賴性（P＜0.05）。加入PI3K抑制劑渥曼青霉素后，PI3K和Akt的蛋白水平有所降低（圖4）。

3.5 TAE對αTC1-6細(xì)胞胰高血糖素、IRS-1、PI3K和Akt的mRNA表達(dá)的影響

如圖5顯示，不加胰島素時(shí)，與正常對照組相比，模型組的胰高血糖素mRNA水平明顯提高，并具有顯著性差異（P＜0.05），IRS-1、PI3K和Akt水平均顯著性降低。與模型組相比，TAE（10μg／mL）能夠輕微降低胰高血糖素的基因表達(dá)并增加IRS-1、PI3K和Akt的表達(dá)。加入胰島素后，與正常對照組相比，模型組胰高血糖素的表達(dá)輕微增加，IRS-1、PI3K和Akt水平都顯著性降低；與模型組相比，TAE能夠顯著性降低胰高血糖素的表達(dá)并顯著性增加IRS-1、PI3K和Akt的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而PI3K抑制劑渥曼青霉素的加入能夠逆轉(zhuǎn)TAE對PI3K和Akt的作用。

Figure 4 Effects of TAE on protein levels of IRS-1，PI3K and Akt inαTC1-6 cells.αTC1-6 cellswere incubated for5 days in DMEM media containing5.5 mmol／L glucose or25 mmol／L glucose in the presence or absence of different concerntration of TAE for24 h with insulin（100 nmol／L）for 4 h.P-IRS-1（A），p-PI3K（B）and p-Akt（C）wasmeasured by Western blot（ˉx±s，n＝3）＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group

Figure5 Effectsof TAE on geneexpression inαTC1-6 cells.αTC1-6 cellswere incubated for5 days in DMEMmedia containing5.5mmol／L glucose or 25 mmol／L glucose in the presence or absence of10μg／mL TAE for24 h with orwithout insulin（100 nmol／L）for4 h，gene expression levels in αTC1-6 cellswere determined and normalized to GAPDH.Data isexpressed as relative level to5.5 mmol／L glucose group without insulin.A：Glucagon levels；B：IRS-1 levels；C：PI3K levels；D：Akt levels（ˉx±s，n＝3）.＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs 5.5 mmol／L glucose（control group）with or without insulin*P＜0.05，**P＜0.01 vs25 mmol／L glucose（model group）in the absence of wortmannin and TAE with or without insulin

4 討 論

胰島素抵抗是2型糖尿病產(chǎn)生的主要病因［15］。研究表明，長期高糖環(huán)境能誘導(dǎo)胰島α細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，導(dǎo)致胰高血糖素異常分泌，產(chǎn)生高血糖［16］。本實(shí)驗(yàn)采用25 mmol／L高糖連續(xù)培養(yǎng)αTC1-6細(xì)胞5 d，成功建立胰島α細(xì)胞胰島素抵抗模型，并考察了TAE的干預(yù)效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：TAE能夠顯著降低高糖誘導(dǎo)的αTC1-6胰高血糖素分泌，升高IRS-1、PI3K、Akt的mRNA和蛋白水平，提示青錢柳三萜酸對胰島α細(xì)胞胰島素抵抗的改善作用可能與激活I(lǐng)RS-1／PI3K／Akt胰島素信號(hào)通路有關(guān)。

αTC1-6是小鼠胰高糖素瘤細(xì)胞株，因其細(xì)胞群體均勻單一并易于培養(yǎng)而優(yōu)選于原代胰島細(xì)胞，是研究胰島α細(xì)胞功能的常用細(xì)胞株之一［16－17］。此外，研究表明αTC1-6細(xì)胞在長期高糖環(huán)境下胰高血糖素分泌和基因表達(dá)的變化與原代細(xì)胞相比，沒有顯著性差異，表明αTC1-6細(xì)胞系具有代表性［18－19］。本實(shí)驗(yàn)用含 25 mmol／L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)αTC1-6細(xì)胞5 d后，細(xì)胞胰高血糖素分泌明顯增加，胰島素對胰高血糖素分泌的抑制作用減弱，表明長期高糖環(huán)境成功誘導(dǎo)αTC1-6細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，導(dǎo)致細(xì)胞胰高血糖素分泌異常，與文獻(xiàn)［14，20］報(bào)道結(jié)果一致，表明 αTC1-6細(xì)胞胰島素抵抗模型建立成功。

“雙激素異?！奔僬f認(rèn)為胰高血糖素分泌過多和胰島素分泌不足是高血糖的主要原因［2，21］。正常生理狀態(tài)下，進(jìn)食后血糖濃度上升，胰島素分泌增多，胰高血糖素分泌受到抑制而減少［22］。而病理狀態(tài)下，持續(xù)的高血糖會(huì)導(dǎo)致胰島α細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，胰高血糖素分泌增多，加劇高血糖［23］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) TAE可顯著降低高糖誘導(dǎo)αTC1-6細(xì)胞的胰高血糖素分泌水平，提示其具有改善胰島α細(xì)胞胰島素抵抗功能。

IRS／PI3K／Akt通路是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑［24］。長期高糖刺激時(shí)，胰島α細(xì)胞對外源性胰島素?zé)o法產(chǎn)生正常應(yīng)答，IRS／PI3K／Akt胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受阻，導(dǎo)致胰高血糖素分泌上升［25］。本研究發(fā)現(xiàn)TAE能顯著降低高糖誘導(dǎo)的αTC1-6細(xì)胞的胰高血糖素水平，增加其胞內(nèi)IRS-1、PI3K和Akt的mRNA和蛋白水平。給予PI3K的抑制劑渥曼青霉素干預(yù)后，PI3K和Akt的表達(dá)明顯降低，胰高血糖素水平顯著上升。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TAE可以改善胰島素抵抗，可能是通過上調(diào)IRS-1和PI3K的酪氨酸磷酸化及其下游Akt的磷酸化來恢復(fù)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起作用。

綜上所述，青錢柳三萜酸部位可通過干預(yù)IRS-1／PI3K／Akt信號(hào)通路改善胰島α細(xì)胞胰島素抵抗，抑制胰高血糖素的分泌，達(dá)到治療糖尿病的效果。但青錢柳三萜酸在動(dòng)物體內(nèi)如何調(diào)控胰高血糖素分泌及哪種類型三萜發(fā)揮藥效，仍需進(jìn)一步深入研究。

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