牛 勇，李 洋，盧延旭

（1.公安部刑事偵查局， 北京 100741；2.公安部物證鑒定中心，北京100038；3.中國刑事警察學(xué)院，沈陽110854）

目前藥物濫用導(dǎo)致人體死亡的案件數(shù)量仍然居高不下，公安法醫(yī)在處理這類案件中不僅要在公共安全預(yù)警監(jiān)測方面發(fā)揮重要作用，也要在公共健康方面進(jìn)行研究做出自己的努力以降低藥物濫用導(dǎo)致人體死亡案件的數(shù)量。在我國因藥物濫用直接導(dǎo)致死亡的案件中，海洛因仍是目前最常見的麻醉性藥品，大量研究已證明海洛因的長時(shí)間濫用能嚴(yán)重影響成癮者的生存率。作為阿片類藥物，海洛因能通過阿片類受體直接影響機(jī)體的免疫細(xì)胞，如降低T細(xì)胞的增殖，阻礙巨噬細(xì)胞的吞噬作用。

作為炎癥反應(yīng)介質(zhì)的白介素（interleukin，IL），在傳遞免疫信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化，增殖與分化及在炎癥反應(yīng)中起重要作用。在靜脈注射海洛因?yàn)E用人群中，其血清中各IL水平，如IL-6、IL-8都受到不同程度的影響，這說明海洛因能通過影響ILs對機(jī)體免疫反應(yīng)過程產(chǎn)生作用。白介素-1 (IL-1)屬于白介素的一種，是由活化的巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生，能夠刺激參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖、分化并提高其功能。對于海洛因能否活化巨噬細(xì)胞功能進(jìn)而直接影響IL-1分泌的研究尚少。

本文采用體外培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，檢測海洛因?qū)奘杉?xì)胞分泌IL-1的作用，證實(shí)海洛因能直接刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-1，進(jìn)一步驗(yàn)證了海洛因能通過對免疫功能的不良影響導(dǎo)致成癮人群死亡率的上升。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

C57BL/6J小鼠，雄雌兼用，體質(zhì)量（20±2） g。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

10 mg/mL鹽酸海洛因（ddH2O配制，pH=5.6）；脂多糖，刀豆球蛋白A（Sigma-Aldrich，圣路易斯，美國）；10%胎牛血清- RPMI1640培養(yǎng)液（105 IU/L青霉素，100 mg/L鏈霉素，pH=7.2， Gibco，美國）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

HH-CP型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療設(shè)備）；55O型酶聯(lián)免疫檢測儀（Bio-Rad，加州，美國）。

1.4 腹腔巨噬細(xì)胞的分離和白細(xì)胞介素-1的誘生[1]

以10%胎牛血清- RPMI1640培養(yǎng)液常規(guī)制備小白鼠腹腔細(xì)胞懸液（2×109/L），并以1 mL/孔標(biāo)準(zhǔn)加入24孔培養(yǎng)板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，獲得單層腹腔巨噬細(xì)胞。Hanks液洗3次，復(fù)孔加入5 mg/L LPS-RPMI 1640培養(yǎng)液1 mL或10μg/mL的鹽酸海洛因1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集上清供IL-1檢測。

1.5 小鼠胸腺細(xì)胞的制備[2]

正常麻醉后處死C57BL/6J小鼠，無菌條件下取胸腺置培養(yǎng)皿中，其內(nèi)裝有尼龍紗網(wǎng)和Hanks液，用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液置離心管內(nèi)3000 r/min離心15 min，棄上清，加入10%胎牛血清- RPMI1640培養(yǎng)液，輕柔吹打細(xì)胞團(tuán)塊至單細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×1010/L。

1.6 IL-1活性的檢測[1]

采用小白鼠胸腺細(xì)胞增殖法檢測。首先，將上述腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液以1∶90稀釋，各取50 μL加入96孔培養(yǎng)板，每孔另加入ConA（終濃度3 mg/L）的RPMI1640培養(yǎng)液50 μL和1×1010/L小鼠胸腺細(xì)胞懸液100 μL（終濃度5×109/L），使每孔終體積為200 μL。其次，將96孔培養(yǎng)板置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)42 h，然后每孔加入5 g/L的MTT 10μL，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。最后，取出各培養(yǎng)孔中的液體依次置入1 mL離心管，3000 r/min離心5 min，棄上清，加入含有0.04 mol/L異丙醇的鹽酸200 μL，重新依次置入原培養(yǎng)孔，震蕩1 min，用酶標(biāo)儀在405 nm處讀A值，結(jié)果以±SD表示。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用SPSS 13.0軟件（IBM，加州，美國）對海洛因?qū)嶒?yàn)組與對照組在λ=405 nm處的A值進(jìn)行t檢驗(yàn)。P＜0.05則認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

體外試驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比較，在腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入鹽酸海洛因（終濃度0.05μg/mL）能使腹腔巨噬細(xì)胞分泌的IL-1活性增加（見圖 1）。

圖1 海洛因?qū)Ω骨痪奘杉?xì)胞分泌IL-1的影響（*P＜0.05）Fig.1 The effect of heroin on the IL-1 activity secreted by peritoneal macrophages（* represents P＜0.05）

3 討論

通過本次體外細(xì)胞試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)較低濃度的海洛因就能夠使小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-1的活性增強(qiáng)，這提示在長期海洛因?yàn)E用致人死亡的機(jī)制中，海洛因能夠通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-1進(jìn)而影響成癮者全身炎癥反應(yīng)。已有研究證明長期藥物濫用者機(jī)體常表現(xiàn)出超出正常人的免疫炎癥反應(yīng)[3]，這可能與阿片類藥物慢性成癮者體內(nèi)免疫細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞膜表面μ受體表達(dá)水平與信號通路的改變有關(guān)[4-5]。對通過靜脈注射使用的濫用藥物可卡因進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，長期注射可卡因能夠?qū)е聻E用者機(jī)體免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)異常增強(qiáng)[6-8]，在我們的實(shí)驗(yàn)中，同作為靜脈濫用類藥品海洛因也能夠提高體內(nèi)IL-1的水平，與可卡因相關(guān)研究的結(jié)果一致。

IL-1是包括三個(gè)氨基酸序列高度同源的蛋白質(zhì)，由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生并有多方面生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中有重要作用。作為體內(nèi)一種重要的炎癥介質(zhì)，它參與和誘導(dǎo)體內(nèi)多種炎癥反應(yīng)通路。在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的同時(shí)，IL-1還能損傷內(nèi)皮細(xì)胞，損害機(jī)體心血管系統(tǒng)。在海洛因?qū)е鲁砂a的過程中，IL-1作為介質(zhì)參與了小鼠腦部海馬區(qū)、杏仁核的炎癥反應(yīng)過程，并很可能通過炎癥反應(yīng)進(jìn)一步參與海洛因成癮、戒斷、復(fù)吸的過程[9]。有研究指出，對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，海洛因可抑制一氧化氮（NO）的產(chǎn)生，進(jìn)而通過作用腦部IL-1而對海洛因成癮者的學(xué)習(xí)、記憶功能產(chǎn)生消極影響[10]，這些研究揭示IL-1或可作為重要遞質(zhì)參與了海洛因成癮過程，因此研究海洛因?qū)C(jī)體中IL-1的影響可為闡明海洛因成癮機(jī)制發(fā)揮重要作用。

因此，研究海洛因?yàn)E用對成癮者體內(nèi)不同組織中IL-1的調(diào)節(jié)作用，不僅能夠提高慢性海洛因?yàn)E用人群的生存率，也能夠幫助成癮者擺脫藥物依賴。本實(shí)驗(yàn)只進(jìn)行了初步探索，證實(shí)了海洛因能刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-1，并增強(qiáng)IL-1的活性，而海洛因?qū)θ梭w免疫系統(tǒng)的影響還需進(jìn)一步系統(tǒng)性的研究。

［1］ 梁君山，魏偉，周愛武，等.白細(xì)胞介素Ⅰ的檢測及白芍總甙對其產(chǎn)生的影響[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào)， 1989(6):354-357.

［2］ 魏偉，吳希美，李元建. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 4版，北京：人民衛(wèi)生出版社，2010.

［3］ CHAN Y Y, YANG S N, LIN J C, et al.Inflammatory response in heroin addicts undergoing methadone maintenance treatment[J].Psychiatry Res, 2015,226 (1) :230-234.

［4］ REGAN P M, DAVE R S, DATTA P K, et al. Epigenetics of micro-opioid receptors: intersection with HIV-1 infection of the central nervous system[J]. Journal of Cellular Physiology,2012,227(7):2832-2841.

［5］ TOSKULKAO T, PORNCHAI R, AKKARAPATUMWONG V, et al. Alteration of lymphocyte opioid receptors in methadone maintenance subjects[J]. Neurochemistry International,2010,56(2):285-290.

［6］ NARVAEZ J C, MAGALHAES P V, FRIES G R, et al. Peripheral toxicity in crack cocaine use disorders[J]. Neuroscience Letters,2013 , 544 (24) :80-84.

［7］ NKAMBULE B B, MKANDLA Z, MUTIZE T, et al. Platelet function and cardiovascular risk in adult HIV-infected patients on HAART: a protocol for a systematic review and metaanalysis[J].BMJ Open, 2017,7 (12) :e019468.

［8］ PEREIRA J, SAEZ C G, PALLAVICINI J, et al. Platelet activation in chronic cocaine users: effect of short term abstinence[J].Platelets, 2011,22 (8) :596-601.

［9］ SZCZYTKOWSKI J L, LEBONVILLE C, HUTSON L, et al.Heroin-induced conditioned immunomodulation requires expression of IL-1beta in the dorsal hippocampus[J].Brain Behavior & Immunity, 2013,30:95-102.

［10］ Hutson L W, Lebonville C L, Jones M E, et al. Interleukin-1 signaling in the basolateral amygdala is necessary for heroinconditioned immunosuppression[J]. Brain Behavior & Immunity. 2017, 62:171-179.