夏侯秋錦，李 鵬，畢文姬，柏澤新，國 菲

（淄博市公安局刑偵支隊，山東 淄博 255000）

敵敵畏（DDVP），是中毒率和死亡率較高的有機(jī)磷農(nóng)藥之一，常見于投毒事件，自殺事件以及食物誤服中毒事件[1-3]。目前，國內(nèi)外對敵敵畏的分解動力學(xué)研究報告較少，主要集中在敵敵畏的檢測方法及農(nóng)作物敵敵畏殘留的檢測[4-8]。在敵敵畏中毒案件中，由于送檢不及時或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)部因素往往都會使得檢材不能及時進(jìn)行檢驗(yàn)。同時，由于案件的需要，常常要求對所送檢材進(jìn)行再次、多次檢驗(yàn)從而確定是否為敵敵畏中毒死亡，毒物會發(fā)生分解，需進(jìn)行保存檢材中分解動力學(xué)研究，明確保存檢材中毒藥物的檢出時限，最佳存儲條件，對于推斷死亡當(dāng)時或檢材采取當(dāng)時體內(nèi)或檢材內(nèi)毒(藥)物濃度意義重大[9]，而關(guān)于敵敵畏的分解動力學(xué)研究僅見一篇報告[10]，并且為單一濃度敵敵畏在動物血中的研究，沒有系統(tǒng)全面地分析不同濃度敵敵畏在人血中的分解動力學(xué)規(guī)律。本文通過檢測人血中5種不同濃度的敵敵畏在-20、4、20 ℃三種保存條件下含量的變化，更系統(tǒng)、更全面研究敵敵畏在人血檢材中的分解動力學(xué)規(guī)律，為敵敵畏中毒案件的法醫(yī)學(xué)鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

AB公司4000Q TRAP液質(zhì)聯(lián)用儀、低溫高速離心機(jī)、渦旋震蕩器、移液器。

1.1.2 試劑

DDVP標(biāo)準(zhǔn)品（購于公安部物證鑒定中心）、甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑均為色譜純；試驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備：

取5份空白血液，分別添加敵敵畏濃度到0.36、0.72、1.5、3.0、5.3 μg/mL，將每份血再分為 3份，分別置于-20、4、20 ℃三種溫度環(huán)境中，在1、2、4、6、8、12、16、20、24、28、32、40、48、64、80、96、120 d進(jìn)行檢測。

1.2.2 樣品的處理

1 mL血液中加入2 mL乙腈，高速渦旋振蕩5 min，12 000 r·min-1高速離心7 min，取上清液過0.22μm濾膜過濾，液質(zhì)聯(lián)用儀定性、定量分析。

1.2.3 液相色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters BEH C18 1.7 μm 2.1×50 mm Column；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：30 μL，流動相A為5 mM乙酸銨水溶液，流動相B為甲醇。流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient setup

質(zhì)譜：正離子掃描；檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測；碰撞氣為氮?dú)?；氣簾氣（CUR）：20 psi；噴撞氣（CAD）：Medium；離子化電壓（IS）：5500 V；溫度（TEM）：500 ℃；噴霧氣（GS1）：50 psi；輔助加熱氣（GS2）：50 psi；接口加熱（ihe）：on；碰撞室入口電壓（EP）：10 V；碰撞室出口電壓（CXP）：6 V；保留時間：2.13 min；221.1/109.1的碰撞電壓為24 eV，221.1/127.1的碰撞電壓為21 eV，其中221.1/109.1為定量離子。

2 結(jié)果

2.1 色譜圖及質(zhì)譜圖

空白血液及添加敵敵畏血液的液質(zhì)聯(lián)用儀色譜圖及質(zhì)譜圖，如圖1～2所示，結(jié)果顯示在選擇的實(shí)驗(yàn)條件下，血液中的雜質(zhì)不影響敵敵畏的測定。

圖1 空白血色譜圖Fig.1 Chromatogram of blank blood

圖2 血中添加敵敵畏色譜圖及質(zhì)譜圖Fig.2 Chromatogram and mass spectrum of DDVP-spiked blank blood

2.2 回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取15份空白全血1 mL，分為3組，每組分別添加敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為0.5、1、4 μg/mL，按1.2.2全血樣品處理項方法處理測定，見表2。

表2 敵敵畏回收率及精密度(n=5)Table 2 Recoveries (REC) and relative standard deviations(RODS) of DDVP (n=5)

2.3 工作曲線

取空白全血分別添加敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.02、0.05、 0.1、 0.2、 0.4、 0.8、 2.0、 4.0、 6.0 μg/mL，按 1.2.2全血樣品處理項方法處理測定，以峰面積（y）-敵敵畏濃度（x）為坐標(biāo)做工作曲線，曲線方程為

y=7.63e5x+3.93e3，其r值為0.9991，線性范圍為0.02 ～ 6.0 μg/mL，最低檢出限為 0.002 μg/mL，S/N>3。

2.4 溫度對保存血液中敵敵畏含量變化的影響

5種濃度敵敵畏在不同溫度下血液中的含量變化見圖 3～7。

圖3 濃度為0.36 μg/mL的敵敵畏在不同溫度保存血中含量變化Fig.3 DDVP of 0.36μg/mL changing under different temperatures for its preservation in blood

圖4 濃度為0.72 μg/mL的敵敵畏在不同溫度保存血中含量變化Fig.4 DDVP of 0.72μg/mL changing under different temperatures for its preservation in blood

圖5 濃度為1.5 μg/mL的敵敵畏在不同溫度保存血中含量變化Fig.5 DDVP of 1.5μg/mL changing under different temperatures for its preservation in blood

圖6 濃度為3.0 μg/mL的敵敵畏在不同溫度保存血中含量變化Fig.6 DDVP of 3.0μg/mL changing under different temperatures for its preservation in blood

圖7 濃度為5.3 μg/mL的敵敵畏在不同溫度保存血中含量變化Fig.7 DDVP of 5.3μg/mL changing under different temperatures for its preservation in blood

采用 WinNonlin 藥代動力學(xué)軟件處理保存血液的平均藥物濃度-時間數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，在 -20 ℃和4 ℃條件下分解均符合一級動力學(xué)過程一室開放模型，可以用Ct=Coe-αt(Ct 為時間 t 測得的含量；Co表示初始含量；t 表示時間，單位:d；α為分解速率常數(shù))表示，在20 ℃保存環(huán)境下分解過快，不宜用動力學(xué)方程表示，分解動力學(xué)參數(shù)見表 4。

表4 敵敵畏分解動力學(xué)參數(shù)Table 4 DDVP decomposition kinetics parameters

同一保存環(huán)境不同濃度敵敵畏的分解速率常數(shù)α均相近，在-20 ℃保存環(huán)境下，分解速率常數(shù)α取平均0.023，分解動力學(xué)方程為Ct=Coe-0.023t，半衰期為30.13 d；在4℃保存環(huán)境下，分解速率常數(shù)α取平均0.35，分解動力學(xué)方程為Ct=Coe-0.35t，半衰期為1.98 d。濃度為3.0 μg/mL的敵敵畏在-20 ℃及4℃保存環(huán)境中濃度-時間曲線如下圖8～9。

圖8 濃度為3.0μg/mL的敵敵畏在-20℃保存環(huán)境中濃度-時間曲線Fig.8 The C-T (concentration-time) curve of DDVP at 3.0 μg/mL in blood stored under -20℃

圖9 濃度為3.0μg/mL的敵敵畏在4℃保存環(huán)境中濃度-時間曲線Fig.9 The C-T (concentration-time) curve of DDVP at 3.0μg /mL in blood kept under 4℃

3 討論

目前研究表明，保存檢材中毒物的分解動力學(xué)主要受保存條件的影響，包括溫度、時間、器皿類型、防腐劑、pH值及其它等[11]。其中，溫度是影響保存生物檢材中毒物分解主要因素之一，毒物在生物檢材中的分解速度與保存溫度相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用血液中不同濃度的敵敵畏在-20、4、20 ℃保存條件下含量的變化，系統(tǒng)的研究敵敵畏在人血檢材中的分解動力學(xué)規(guī)律。結(jié)果顯示，不同濃度敵敵畏含量在-20、4、20 ℃保存條件中均呈下降趨勢，隨著溫度的升高，敵敵畏降解速度加快。在-20 ℃條件下，保存120 d仍然可以檢測到的敵敵畏的存在；在 4 ℃條件下，敵敵畏在 12 d后未能檢出；在20 ℃條件下，4 d后即檢測不出敵敵畏。由此可以得出：隨著溫度的升高，各檢材中敵敵畏分解加快，穩(wěn)定性降低。在-20 ℃條件下，敵敵畏具有較好的穩(wěn)定性，在120 d仍可檢出。這也提示日常工作中，由于各種原因?qū)е虏扇z材后無法立即送檢、檢驗(yàn)的，應(yīng)當(dāng)?shù)蜏乇４妗?20 ℃條件下，120 d檢材中敵敵畏含量約為初始含量的 10%，因此在低溫條件下保存的敵敵畏檢材也應(yīng)盡快送檢、檢驗(yàn)，以免長時間保存造成敵敵畏分解而無法檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用所擬合的Ct=Coe-αt公式和參數(shù)計算的血中敵敵畏的理論值與實(shí)測值接近，說明應(yīng)用血中毒物分解動力學(xué)數(shù)學(xué)模型和參數(shù)，可以模擬生物檢材中敵敵畏濃度的經(jīng)時變化，估算檢材保存期間任一時間的毒物濃度；同時顯示在同一保存溫度下，不同濃度的敵敵畏在血液中的分解速率常數(shù)α及半衰期相近，判斷不同濃度的敵敵畏在同一保存條件下分解速率相近。在敵敵畏中毒（死）案件法醫(yī)學(xué)鑒定時，可采用此分解動力學(xué)方程和參數(shù)來推斷檢材采取當(dāng)時或中毒死亡當(dāng)時的毒物濃度，正確分析和使用毒物分析結(jié)果，為敵敵畏中毒（死）案件法醫(yī)學(xué)鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

綜上所述，敵敵畏在保存血液中極不穩(wěn)定，分解很快，低溫保存可以減緩其分解，分解動力學(xué)過程可用一級動力學(xué)過程一室開放模型來描述。敵敵畏中毒（死）案件法醫(yī)學(xué)鑒定中，檢材應(yīng)低溫冷凍保存，立即送檢并檢驗(yàn)。如果檢材保存時間較長，可用其分解動力學(xué)方程和參數(shù)估算檢材采取或送檢當(dāng)時的敵敵畏濃度。

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