劉振平，楊 揚，童繼軍，翟仙敦

（1.金華市公安局物證鑒定中心，浙江 金華 321000；2.河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽 471003）

STR基因座三帶型模式(Triallelic patterns or threebanded pattern)[1-2]與off - ladder和引物結(jié)合位點突變造成的沉默(silent)等位基因是法醫(yī)STR分型中遇到的三大類問題[3]，本研究通過對37 737例無關(guān)個體進行STR檢驗，對其中的三帶型頻率、類型、易發(fā)基因座、峰高比例等作分析，以期有所發(fā)現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 樣本

收集健康無關(guān)個體血斑樣本37 737例，均為本物證鑒定室受理的人員樣本。

1.2 主要儀器和試劑

9700型擴增儀，ABI3130XL基因分析儀，GeneMapper?ID-X軟件，Globlefiler試劑盒（均為美國AB公司產(chǎn)品）；STRtyper -21G試劑盒（寧波海爾施基因科技有限公司）；PowerPlex21試劑盒（美國普洛麥格公司）。

1.3 方法

37 737例血斑經(jīng)STRtyper-21G試劑盒直接擴增，查找出疑似三帶型樣本。驗證樣本采用5% chelex-100法提取，PowerPlex21（與STRtyper -21G試劑盒基因座完全相同）和Globlefiler試劑盒擴增。擴增體系和熱循環(huán)反應(yīng)按試劑盒說明書進行。擴增產(chǎn)物經(jīng)ABI3130XL基因分析儀電泳，GeneMapper?ID-X軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 24例三帶型STR分型結(jié)果

STRtyper -21G直擴試劑盒檢驗37 737例檢材，共檢出疑似三帶型26例，未出現(xiàn)單一樣本有2個或2個以上基因座3條帶的情況，經(jīng)PowerPlex21、Globlefiler試劑盒驗證，21例確證為三帶型（表1），分型結(jié)果相同，且峰高比例也一致，2例排除，多出的一條帶為相鄰基因座的稀有等位基因，3例不能定論。

表1 檢出三帶型的基因座Table 1 Loci harboring three-banded patterns

2.2 檢出三帶型的特征

本研究共檢測20個STR基因座，有10個基因座檢出21例三帶型（表1），檢出總頻率為0.0556%(21/37737)，其中FGA、TPOX基因座檢出率最高，二者均為0.0106%（4/37737），其次為PentaE基因座，為 0.0079%（3/37737）；D5S818、vWA、D6S1043分別為2例；CSF1PO、D13S317、D12S391和D1S1656分別為1例。CSF1PO、D13S317和D6S1043各1例不能定論。21例三帶型共有6種峰高比（圖1），分別為 3∶2∶1(42.86%，9/21)，1∶1∶1(28.57%，6/21)，2∶1∶1(14.29%，3/21)，2∶1∶3(4.76%，1/21)，3∶1∶2(4.46%，1/21)，1∶2∶3(4.767%，1/21)。不能定論的 3 例樣本峰高比為 4∶1∶4（圖 1）。

圖1 7種不同類型峰高比分型圖譜Fig.1 Seven-type STR profiles of three-banded pattern with various peak height ratios

3 討論

正常人是二倍體，常染色體單個STR基因座的等位基因分型表現(xiàn)為純合子或雜合子，純合子個體圖譜表現(xiàn)為只有1條帶或者1個峰，雜合子個體圖譜表現(xiàn)為2條帶或者2個峰。個別情況下，單個STR分型圖譜會出現(xiàn)3條帶或3個峰，且檢測結(jié)果可重復(fù)，此種情況就是所謂的三帶型。對三帶型的判讀，應(yīng)首先排除污染、混合樣本、基因嵌合體或移植嵌合體等因素。若單個基因座出現(xiàn)三帶，還要注意排除熒光染料污染峰、pull-up峰、非特異性帶、相鄰基因座出現(xiàn)過大或過小的稀有等位基因恰好位于疑似“三帶型”基因座ladder范圍內(nèi)等因素[1-3]。而后，再通過不同試劑盒對照驗證，最終才可確認為三帶型等位基因[4]。

本研究通過對37 737例健康無關(guān)個體進行20個STR基因座的分型分析，獲得26例疑似三帶型樣本，用相同的試劑盒復(fù)核，排除了污染、混合樣本等原因，再用PowerPlex21、Globlefiler兩種不同的試劑盒進行驗證確認，所有分型結(jié)果均相同，且峰高比例一致（圖2、3），最終確認檢出的21例個體確實存在三帶型等位基因，2例為跨基因座稀有等位基因（圖4）。共有10個基因座檢出三帶型，檢出總頻率為0.0556%，主要分布在FGA、TPOX、PentaE和D6S1043基因座，這與國內(nèi)研究的出現(xiàn)三帶型的基因座分布有出入[5-8]，其原因可能為群體樣本來源及統(tǒng)計數(shù)量差異造成。試驗采用的STRtyper -21G試劑盒包含有以蛋白質(zhì)編碼鏈命名的基因座6個，非蛋白質(zhì)編碼鏈命名的基因座14個和1個性別基因座。21例三帶型分布于10個基因座，其中存在于蛋白質(zhì)編碼鏈命名的基因座14例、非蛋白質(zhì)編碼鏈命名的基因座7例，兩者比率為4.67/1，推測位于蛋白質(zhì)編碼鏈區(qū)的基因座更易發(fā)生三帶型，這可能涉及到蛋白質(zhì)功能，或者與某種疾病相關(guān)[2,9]。

圖2 峰高比為4∶1∶4時不同試劑盒驗證圖譜Fig.2 STR profiles validated with different kits for the allele showing peak ratio of 4∶1∶4

圖3 峰高比為3∶2∶1時不同試劑盒驗證圖譜Fig.3 STR profiles validated with different kits for the allele showing peak ratio of 3∶2∶1

Clayton把三帶型分為2類[3]：最常見的是Type1型，表現(xiàn)為三個峰高不均衡，典型代表特征是其中兩個峰的峰高之和約等于另一個峰，其發(fā)生原因可能與雜合子基因座體細胞突變有關(guān)；其次是Type2型，表現(xiàn)為三個峰的峰高接近，其發(fā)生原因可能與雜合子基因座染色體重排有關(guān)。按照這一原則，本次研究觀察到的 3∶2∶1、2∶1∶1、2∶1∶3、3∶1∶2 和 1∶2∶3 屬于 Type1 型（15/21），1∶1∶1 屬于 Type2 三帶型 (6/21)。相比其他學(xué)者報道的 2∶1∶1 或者 1∶1∶1[5-7,10-11]的三帶型峰高比值，本文檢測到的類型更多，推測與群體樣本更大有關(guān)。

圖4 D21S11基因座稀有等位基因不同試劑盒驗證圖譜Fig.4 STR profiles validated with different kits for the rare alleles in D21S11 locus

值得注意的是，本次試驗中有3例樣本均有一個基因座峰高比為4∶1∶4，其特點是兩個峰較高且相對均衡，低峰約為高峰的1/4，高于stutter峰范圍（如圖1、2中PowerPlex21檢測圖譜），為排除可能存在污染或者其它非特異峰情況，作者又對檢材重新提取，使用相同試劑盒、不同試劑盒、單基因座擴增進行了驗證，發(fā)現(xiàn)該低峰始終存在，且同一樣本中其它基因座、同批次試劑擴增的其它樣本stutter均在正常范圍，故推測出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能與樣本來源有關(guān)?？紤]到三帶型、stutter峰產(chǎn)生的機理比較復(fù)雜，確認該低峰類型還需進行測序或者其它方法予以證實，在此，作者僅對觀察到的該現(xiàn)象予以報道，以供研究者參考。

截止目前，查詢STR數(shù)據(jù)庫(http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/)，共收錄三帶型等位基因388例，本研究的21例三帶型中有8例三帶型未被收錄（見表1）；D21S11共收錄等位基因45個，本試驗經(jīng)不同試劑盒驗證確認的稀有等位基因10、47均未被收錄（圖4），檢驗結(jié)果同時提示，D21S11出現(xiàn)跨基因座稀有等位基因的可能性較大，數(shù)據(jù)分析時，應(yīng)當引起重視。當數(shù)據(jù)整體較為平衡、雜合子純合子峰高比例也合理，D21S11基因座表現(xiàn)為一條帶，而相鄰基因座等位基因為三條帶或者為兩條帶但峰高比例嚴重不均衡時，應(yīng)考慮到其中的一條帶可能為D21S11基因座的跨基因座等位基因。

綜上，典型峰高比為 2∶1∶1 或 1∶1∶1 的三帶型應(yīng)該不難判定。峰高差異大的三帶型，如3∶2∶1，判讀需慎重，因極易出現(xiàn)漏判或者錯斷,數(shù)據(jù)分析時應(yīng)首先要保證儀器處于最佳狀態(tài)，靈敏度高；其次，擴增時加入的模板純度要好，濃度適當，嚴格按試劑盒說明設(shè)置循環(huán)參數(shù)；再是擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果基線平，圖譜均衡，stutter峰處于正常范圍，無雙肩峰、pullup峰干擾以及不存在非特異性帶。在此基礎(chǔ)上，若單個基因座出現(xiàn)三帶，應(yīng)使用不同試劑盒驗證，必要時進行單基因座擴增和測序確定。

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