張廣峰，高 珊，暢晶晶，徐小玉，郝金萍，楊雪瑩，朱 典，張 穎，張 瑾，凃 政，劉開會

（公安部物證鑒定中心，北京 100038）

近年來，Y-STR檢驗(yàn)在法醫(yī)DNA領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，特別是利用Y-STR單倍型進(jìn)行家系排查在偵查破案中發(fā)揮了重要作用。如果不考慮突變因素，Y-STR單倍型在遺傳過程中將會保持不變，這便是家系排查工作的理論基礎(chǔ)。然而，Y-STR基因座的突變現(xiàn)象常會給父系親緣關(guān)系的鑒定和家系排查工作帶來困擾，特別是在當(dāng)前檢驗(yàn)的Y-STR基因座數(shù)量日益增多，并且包含較多的高突變率Y-STR基因座的情況下尤甚。研究表明，不同的Y-STR基因座具有不同的突變率，常用的Y-STR基因座的平均突變率在2‰～3‰左右[1]。Ballantyne K等[2]發(fā)現(xiàn)DYF387S1、DYS399S1、DYF403S1、DYF404S1、DYS449、DYS518、DYS526b、DYS547、DYS570、DYS576、DYS612、DYS626和DYS627等13個Y-STR的突變率在10‰以上，故稱其為快速突變 Y-STR（Rapidly Mutating, RM Y-STR）基因座。目前，對于Y-STR突變率的調(diào)查和Y-STR單倍型在不同家系中的多樣性研究較多[2-5]，而對于同一家系中不同男性個體之間的Y-STR單倍型變化程度研究則較少[6-7]?？墒?，父系親緣關(guān)系的鑒定和家系排查工作都需要對家系中Y-STR單倍型的變化程度有整體上的認(rèn)知。

本研究選取一遺傳關(guān)系清晰的漢族家系，利用Yfiler?Plus復(fù)合擴(kuò)增試劑盒（包含16個YfilerY-STR基因座和DYF387S1、DYS449、DYS518、DYS570、DYS576、DYS627等6個RM Y-STR基因座）和另 一 包 含 DYS399S1、DYF403S1、DYF404S1、DYS526b、DYS547、DYS612、DYS626等 7個 RM Y-STR基因座的復(fù)合擴(kuò)增體系，獲得了所采樣本的32個Y-STR基因座的分型數(shù)據(jù)，并比較了Yfiler、YfilerPlus和RM Y-STR單倍型在世代遺傳過程中的變異程度的差異，希冀為父系親緣關(guān)系鑒定和家系排查提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

選取一遺傳關(guān)系清晰的漢族家系（圖1），按照知情同意的原則，共采集到其中47名男性個體的口腔拭子樣本。樣本編號以代數(shù)+序號表示，如8-1表示家系中的第八代第一名個體。由于家系圖中部分個體的樣本未能采集，故樣本編號存在有不連續(xù)的現(xiàn)象。家系中兩兩個體之間的親緣距離為1次減數(shù)分裂（父子對，此處指產(chǎn)生后代的實(shí)際顯效減數(shù)分裂）到19次減數(shù)分裂（如樣本12-1與11-34）。

圖1 家系圖譜以及突變位置定位（有編號的藍(lán)色方框代表實(shí)驗(yàn)樣本，其他為逝者或未能采集到的樣本；表示準(zhǔn)確的突變位置，其他均為推測的突變位置；紅色:RM Y-STRs;黑色:其他Y-STRs）Fig.1 Lineage map and mutations localized (Blue bars with serial numbers: tested samples; the others: deceased or unavailable representatives.indicting the precise site of mutation; the others: the deduced site of mutation. Red: RM Y-STRs, Black: other Y-STRs)

1.2 儀器試劑

ABI9700型PCR擴(kuò)增儀；ABI3500xL型遺傳分 析 儀；MagAttractM48 DNA Manual Kit(Qiagen)；Yfiler?Plus試劑盒 ；2×PCR Master Mix (Promega)；GeneScan600 LIZ Size Standard；Hi-DiFormamide(Applied Biosystems)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

使用M48試劑盒提取樣本DNA。使用Yfiler?Plus試劑盒和7個RM Y-STRs復(fù)合擴(kuò)增體系對DNA進(jìn)行擴(kuò)增。試劑盒的具體操作均參照產(chǎn)品說明書。7個RM Y-STRs復(fù)合擴(kuò)增體系(10 uL)包括：5 μL 2×PCR Master Mix (Promega)，4 μL Primer Mix(引物序列參照Ballantyne等[2]，終濃度為0.4 μM)，DNA 模板1μL。PCR程序如下：95 ℃、2 min；28個循環(huán) (94 ℃、30 s; 59 ℃、40 s; 72 ℃、40 s)；72 ℃、20 min。PCR產(chǎn)物在ABI3500xL遺傳分析儀上進(jìn)行檢測。

1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

7個RM Y-STRs復(fù)合擴(kuò)增體系中等位基因的命名：對樣本10-1每個基因座的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，根據(jù)核心序列的重復(fù)次數(shù)對其等位基因分型進(jìn)行命名；對于其他樣本，減少一個重復(fù)序列長度的等位基因的命名在10-1的基礎(chǔ)上減1，增加一個重復(fù)序列長度的等位基因的命名在10-1的基礎(chǔ)上加1。根據(jù)樣本之間的親緣關(guān)系和Y-STR分型數(shù)據(jù)，在家系圖中定位突變發(fā)生的位置。

突變位置的定位遵照以下原則：1）若父子之間某Y-STR基因座分型不一致，則突變位置可以直接定位在父子之間的傳代過程；2）若家系中某一分支的個體在某基因座上與其他分支人員不一致，考慮到突變的稀有性，認(rèn)為在這個分支與其他分支分離的部位發(fā)生了突變。

比如，樣本10-9和11-11 DYS547的分型為48,而 10-8、10-10、12-5DYS547的分型均為 49，最合理的解釋是樣本10-8、10-9、10-10的父親的DYS547的分型應(yīng)為49,只是在傳遞給10-9的過程中突變?yōu)?8；再比如10-11、10-12、11-13、11-14、11-15的DYS481分型為22,而與這個分支臨近的其他樣本均為23，最合理的解釋是10-11和10-12所在的這個分支發(fā)生了突變，可能是在10-11與10-12的祖父傳遞給10-11與10-12的父親時發(fā)生了突變，也可能是其曾祖父傳遞給其祖父時發(fā)生了突變，只有這樣才能通過一次突變導(dǎo)致這個分支的所有成員的DYS481分型與其他分支不一樣。

根據(jù)突變定位的結(jié)果統(tǒng)計Y-STR基因座的突變次數(shù)；由于樣本較少，涉及到的減數(shù)分裂次數(shù)不足（106次），未分別計算每個Y-STR基因座的突變率。統(tǒng)計家系中Yfiler、YfilerPlus和RM Y-STR 3種Y-STR單倍型的個數(shù)并比較兩兩個體之間的最大差異基因座個數(shù)和單倍型差異率(Rate Referred to Haplotype Differences,RRHD)[6]。RRHD指家系中具有特定親緣距離(減數(shù)分裂次數(shù))的兩名男性個體之間單倍型不一致(≥1個基因座的分型不同)的概率，表示為單倍型不一致的樣本對數(shù)/總樣本對數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 Y-STR基因座突變分析

在7個RM Y-STR復(fù)合擴(kuò)增體系中，DYS399S1（三拷貝Y-STR基因座）等位基因峰圖擴(kuò)增不平衡現(xiàn)象較為明顯，且部分樣本檢測出4至5個等位基因，分型判斷難度較大，因此，數(shù)據(jù)分析剔除了DYS399S1基因座。在剩余的31個Y-STR基因座中，14個Y-STR基因座檢出1個以上的等位基因，推測共發(fā)生了27次突變，其中DYS626突變4次，DYS518、DYS612和DYS627各突變3次,DYF404S1、DYS481、DYS526b和DYS547各突變2次，DYF-403S1a、DYF387S1、DYS389II、DYS437、DYS391和DYS635各突變1次。其余17個Y-STR基因座未發(fā)現(xiàn)新等位基因,認(rèn)為沒有突變發(fā)生（未考慮傳代過程中可能發(fā)生的回復(fù)突變）。突變發(fā)生的位置（或可能的位置）見圖1。在27次突變中，9個RM Y-STR (DYS626、DYS518、DYS612、DYS627、DYF404S1、DYS526b、DYS547、 DYF403S1a、DYF387S1)突變21次，占77.8%；另外5個Y-STR(DYS481、DYS389II，DYS437，DYS391，DYS635)突變6次，僅占22.2 %。減少重復(fù)單位的突變?yōu)?3次，占48.1 %，增加重復(fù)單位的突變?yōu)?4次，占51.9%。27次突變均為1步突變。全部31個基因座的平均突變率為7.08‰ (95% CI, 4.7‰～10.3‰)，12個RM Y-STR基因座的平均突變率為12.4‰ (95% CI,7.7‰～18.9‰)，其余19個基因座的平均突變率為2.83‰ (95% CI, 1.0‰ ～ 6.2‰)。

2.2 三種Y-STR分型體系在樣本之間的差異比較

在47名男性家族成員中，發(fā)現(xiàn)4種Yfiler單倍型，12種YfilerPlus單倍型，16種RM Y-STR單倍型，對于全部31個Y-STR基因座，發(fā)現(xiàn)21種單倍型（表1）。

表1 47名男性個體的Y-STR單倍型Table 1 Y-STR haplotypes of 47 male individuals

續(xù)表1

對于Yfiler單倍型，兩兩個體之間最大差異基因座數(shù)為3個（如樣本9-9與11-19）；對于YfilerPlus單倍型，兩兩個體之間最大差異基因座數(shù)為4個（如樣本9-2與11-5）；對于RM Y-STR單倍型，兩兩個體之間最大差異基因座數(shù)為5個（如樣本10-13與11-3）；對于31個Y-STR組成的單倍型，兩兩個體之間最大差異基因座數(shù)為6個（如樣本10-32與11-3）。47名個體兩兩之間的親緣距離介于1次減數(shù)分裂到19次減數(shù)分裂，樣本對數(shù)為13至134對，共計1081個樣本對。兩兩個體之間的RRHD以及最大差異基因座數(shù)見表2。當(dāng)兩名個體相隔一次減數(shù)分裂（父子）時，計算RRHD，Yfiler單倍型為0，YfilerPlus單倍型是4.76%，RM Y-STR單倍型則為23.8%，全部31個Y-STR的RRHD為28.57%；當(dāng)兩名個體相隔10次減數(shù)分裂時，對于RRHD，Yfiler單倍型為7.35%，YfilerPlus單倍型為91.18%；RM Y-STR單倍型和全部31個Y-STR組合值為100 %。

3 討論

Y-STR單倍型中Y-STR基因座數(shù)量越多，在同一家族中單倍型產(chǎn)生差異的概率就越大。在本研究中，同一家族中47名男性個體發(fā)現(xiàn)了4種Yfiler單倍型，12種YfilerPlus單倍型，16種RM Y-STR基因座，另外，Y-STR的突變率對單倍型的變異程度影響較大，比如12個RM Y-STR組成的單倍型的差異程度超過了25個Y-STR組成的YfilerPlus單倍型。這提示我們，當(dāng)分型體系中Y-STR個數(shù)較多或者含有RM Y-STR基因座時，排除家系一定要慎重。當(dāng)前，廣泛應(yīng)用的Y-STR復(fù)合擴(kuò)增體系包含Y-STR基因座越來越多，并且引入了部分的RM Y-STR基因座，這在增加單倍型多樣性的同時也增加了誤排父系親緣關(guān)系的風(fēng)險。對于16個YfilerY-STR基因座，一般認(rèn)為，3個及以上基因座的不一致可以排除父子關(guān)系[8]；Liu 等[9]提出，對于Yfiler單倍型，不超過2個基因座不一致（累計突變步數(shù)不大于2步）提示兩名個體來源于同一家系的可能性非常大，對于YfilerPlus單倍型，這一標(biāo)準(zhǔn)為不超過4個基因座不一致（累計突變步數(shù)不大于5步）。我們認(rèn)為，上述標(biāo)準(zhǔn)仍有適當(dāng)放寬的必要，特別是在同一家系中的兩人親緣距離較遠(yuǎn)的情況下，比如本研究中就發(fā)現(xiàn)了兩名個體17個Yfiler Y-STR基因座中有3個基因座不一致的情況（表2）。另外，在基因座數(shù)量進(jìn)一步增加特別是分型體系中包含RM Y-STR的情況下，排除標(biāo)準(zhǔn)需要根據(jù)具體情況進(jìn)行分析，綜合考慮突變的性質(zhì)（突變基因座的個數(shù)、突變率、突變步數(shù)等），可以預(yù)見，如果個體之間親緣距離更遠(yuǎn)，或者Y-STR基因座的數(shù)量繼續(xù)增加，分型不一致的基因座的數(shù)量仍將繼續(xù)增加。

家系內(nèi)男性個體之間的RRHD隨著減數(shù)分裂次數(shù)的增多和Y-STR基因座數(shù)量的增加而逐漸增大，這也提示我們，增加Y-STR基因座特別是RM Y-STR基因座的數(shù)量可以在家系內(nèi)部進(jìn)一步細(xì)化區(qū)分親緣關(guān)系，甚至為利用Y-STR單倍型進(jìn)行個體識別提供了可能；本研究中，當(dāng)兩名個體相隔10次減數(shù)分裂時，YfilerPlus單倍型的差異率為91.18%，RM Y-STR單倍型差異率則達(dá)到了100%，甚至有23.8%的父子對個體的RM Y-STR單倍型存在差異，這與Ballatyne等人的研究結(jié)果一致[10]。同時，Y-STR數(shù)量的增加和RM Y-STR的應(yīng)用使得父系親緣關(guān)系判定更為復(fù)雜，在實(shí)踐中需要權(quán)衡利弊，根據(jù)需要選用不同的Y-STR分型體系。

表2 三個Y-STR分型體系的單倍型比較Table 2 Comparison of haplotypes obtained from three different Y-STR kits

［1］ YHRD:Y-chromosome STR haplotype reference database[DB/OL]. [2016-09-01]http://yhrd.org/.

［2］ BALLANTYNE K,MIRIAM G, RIXUN F, et al. Mutability of Y-chromosome microsatellites:Rates, characteristics, molecular bases, and forensic implications[J]. American Journal of Human Genetics,2010,87(3):341-353.

［3］ CCONCETTA B, MIGUEL N.Mutation rate estimates for 110 Y-chromosome STRscombining population and father–son pair data[J].European Journal of Human Genetics,2011, 19(1):70–75.

［4］ 吳微微，王懷鋒，郝紅蕾，等. 中國漢族人群46個YSTR基因座多態(tài)性與突變調(diào)查[J]. 中國法醫(yī)學(xué)雜志，2015,30(3):256-259.

［5］ 王瑛，張楚楚，李燃，等.中國南方漢族群體27個Y-STR基因座的遺傳多態(tài)性及突變研究[J].中山大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2015, 36(5): 650-656.

［6］ 彭珊，劉超，王瑛，等. Y-STR遺傳標(biāo)記在大家系中的突變[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2015, 31(2):109-111.

［7］ LIU H, JIN G W, YANG X Y, et al. Analysis of Y-STR haplotype by pedigree in three surname-concentrated villages[J].Forensic Science & Technology, 2015, 40(6):450-456.

［8］ GJERTSON DW, BRENNER CH, BAUR MP, et al.ISFG:Recommendations on biostatistics in paternity testing[J].Forensic Science International Genetics, 2007, 1(3): 223–231.

［9］ LIU H, LI X, MULERO J, et al. A convenient guideline to determine if two Y-STR profiles are from the same lineage[J].Electrophoresis, 2016, 37(12):1659-1668.

［10］ BALLANTYNE K, ARWIN R, RACHID A, et al. Toward male individualization with rapidly mutating Y-chromosomal short tandem repeats[J]. Human Mutation, 2014, 35(8):1021-1032.